Aspectos estruturais dos eventos moleculares associados à regulação e seletividade do transporte de cargas celulares pelas miosinas de classe V humanas

Autor(es)

Andrey Fabricio Ziem Nascimento

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2014-05-23

Membros da banca

Mário Tyago Murakami; Hernán Francisco Terenzi; Marcos Roberto de Mattos Fontes; Artur Torres Cordeiro; Jörg Kobarg

• Orientador: Mário Tyago Murakami

Resumo

As miosina de classe V, amplamente distribuídas em sistemas eucarióticos desde leveduras até vertebrados, são um dos mais caracterizados motores moleculares da superfamília das miosinas e desempenham um papel chave no transporte intracelular de vesículas, organelas e RNA mensageiro. As miosinas V consistem de duas cadeias pesadas idênticas que se dimerizam através da formação de uma estrutura coiled-coil e sua arquitetura tridimensional pode ser dividida em três distintos domínios: a porção N-terminal ou domínio motor que apresenta os sítios de interação com ATP e actina; a porção central ou pescoço formada por 6 domínios IQ, responsável pela regulação e interação com calmodulina; e a porção C-terminal que inclui a região coiled-coil e o domínio de ligação de cargas celulares também conhecido como domínio cauda globular (GTD). Uma das mais importantes questões pertinentes até hoje é como ocorre a sinalização e a interação entre as vesículas/organelas e o domínio globular C-terminal das miosinas V. Neste estudo, foram resolvidas as estruturas dos domínios cauda globular das miosinas Va, Vb e Vc humanas, revelando pequenas mudanças estruturais que levam a diferenciação funcional e, ainda, um novo mecanismo redox que controla a dimerização do GTD de forma independente do coiled-coil, que é exclusivo para a miosina Vc. As alterações estruturais induzidas pela fosforilação do GTD também foram exploradas, mostrando que o estado fosforilado possuí uma flexibilidade menor, podendo estar envolvido na regulação do estado inibido e/ou reconhecimento de cargas nucleares. Além disso, os sítios de ligação a carga e ao domínio motor foram estruturalmente anotados, indicando uma conservação de resíduos envolvidos na interação com adaptadores para o transporte de peroxissomos e proporcionando detalhes da inibição da atividade motora pelo GTD. Estes resultados contribuem para a compreensão dos determinantes estruturais para o transporte de carga, autoinibição e mecanismos de regulação dos motores de miosina V. Além dos resultados obtidos com a cauda globular, alguns problemas cristalográficos como o problema da fase, pseudosimetria e ordem-desordem cristalina foram abordados (descrito nos Apêndices 9.3 e 9.4). Patologias cristalinas como ordem-desordem parcial ou total podem estar relacionadas à valores elevados de Rfactor e Rfree, mesmo após a conclusão do refinamento, ou mesmo à dificuldade de resolução da estrutura. Problemas de ordem-desordem rotacional parcial e pseudosimetria foram observados em cristais de uma hidrolase glicosídica (TpAbn). Nesse caso, valores satisfatórios de Rfactor e Rfree foram obtidos somente após um minucioso processamento dos dados e redução da simetria. Além disso, os dados dos GTDs das miosinas de classe V foram utilizados como caso teste para o desenvolvimento de novas metodologias de faseamento ab initio em média e baixa resolução (2 ¿ 3 Å) em colaboração com o grupo de Prof. Dr. Isabel Usón (IBMB, Barcelona, Espanha). Utilizando o programa ARCIMBOLDO foi possível resolver a estrutura do GTD-MioVb a 2,1 Å utilizando apenas duas hélices de poli-Ala de 22 resíduos (7,5% do conteúdo da unidade assimétrica), mostrando o grande potencial desta metodologia para dados de média a baixa resolução (AU)

• Processo FAPESP: 09/14257-8 - Estudos estruturais do domínio globular da miosina Va humana responsável pelo transporte intracelular de organelas e vesículas
• Beneficiário: Andrey Fabricio Ziem Nascimento
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto