Estudos estruturais e funcionais de duas glicosideo hidrolases: a celulase putativa XF0810 de Xylella fastidiosa e a lisozima digestiva 1 de Musca domestica

Autor(es)

Amanda Abdalla Valerio

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2007-07-25

Membros da banca

João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa; Celso Eduardo Benedetti; Jörg Kobarg; Richard Charles Garratt; Sonia Maria de Freitas

• Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa

Resumo

Glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.-) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas. Neste trabalho realizamos estudos funcionais e estruturais de duas glicosídeo hidrolases: a celulase XF0810 de Xylella fastidiosa e a lisozima digestiva 1 de Musca domestica (MdL1). A celulase XF0810 está anotada no genoma da X. fastidiosa como membro da família 5 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.4). Após a amplificação, clonagem, expressão e purificação da mesma; prosseguimos com os experimentos de filtração em gel analítica, dicroísmo circular, DLS, ensaio enzimático e cristalização desta proteína. Foi feito um estudo de modelagem onde ficou evidenciado que a XF0810 não pertenceria à família 5 pois quatro dos sete resíduos conservados que caracterizam esta família foram substituídos, incluindo os dois resíduos catalíticos de glutamato essenciais para o mecanismo de clivagem de retenção. Isto foi comprovado através da ausência de atividade nos ensaios feitos com a proteína purificada. A MdL1 pertence à família 22 das glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1.17) e foi cristalizada com o ligante Nacetilquitotetraosídeo para a difração de raios X. A resolução da estrutura (2H5Z no PDB) foi realizada por meio do método de substituição molecular tendo como modelo a estrutura nativa. A análise comparativa da MdL1 com outras lisozimas de quatro classes diferentes de animais mostrou grande semelhança e pequenas diferenças apenas na região das voltas. Estas diferenças foram utilizadas para explicar as características especiais de uma lisozima com função digestiva. A volta na região definida pelos resíduos 98-100 apresenta uma deleção na MdL1, tornado-a menos exposta ao solvente, podendo justificar a resistência à proteólise. O resíduo Gln100 participa de uma interação com o ligante. Os resíduos Thr107 e Asn46 são apontados como responsáveis pelo decréscimo dos pKa dos grupos carboxilas dos resíduos catalíticos Glu32 e Asp50, respectivamente. A diminuição dos pKa explica o pH ótimo mais ácido característico de lisozimas digestivas (AU)

• Processo FAPESP: 02/10634-2 - Estudos estruturais e funcionais de hidrolases de Xylella fastidiosa
• Beneficiário: Amanda Abdalla Valério
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado