Caracterização da DNase da peçonha da serpente Bothrops alternatus: comparação com a DNase acida de mamiferos envolvida em apoptose

Autor(es)

Juliana Minardi Nascimento

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2008-02-29

Membros da banca

Stephen Hyslop; Patricia Aline Boer; Roger Frigério Castilho; Carmen Veríssima Ferreira; Soraia Soubhi Smaili

• Orientador: Stephen Hyslop; Carla Beatriz Collares Buzato

Resumo

As peçonhas de serpentes Bothrops são responsáveis por diversos danos locais (na região da mordida) e sistêmicos durante o envenenamento. Dentre as manifestações sistêmicas, a insuficiência renal aguda e um dos mais importantes efeitos tóxicos causados por acidentes botropicos. Esta tese teve como objetivos: 1) investigar a ação da peçonha bruta de B. alternatus em células epiteliais renais MDCK; 2) proceder a purificação e caracterização de uma DNase acida presente nesta peçonha; e 3) determinar a possível ação apoptotica desta DNase sobre células MDCK em cultura. Com relação as ações in vitro do peçonha bruta de B. alternatus, observamos modificações no citoesqueleto, nas junções intercelulares e sobre a morte celular das células MDCK tratadas com 10 ou 100 µg/mL de peçonha bruta. Dentre as modificações observadas, houve uma diminuição da resistência transpitelial, uma redistribuição de algumas proteínas associadas as junções intercelulares acompanhada por um desarranjo do citoesqueleto envolvendo as fibras de estresse na superfície basal e adesão focal associada a F-actina na região de contato celula-matriz. A analise morfometrica mostrou uma diminuição do numero de células entrando em mitose e um aumento do numero de células com núcleos picnoticos ou morfologicamente alterados apos tratamento com o peçonha. Microscopia eletrônica de varredura revelou uma densidade de microvilosidades diminuída, assim como a alteração da morfologia celular normal, de poliédrico para um formato fusiforme, nas células tratadas. O tipo principal de morte celular induzido pelo tratamento com o peçonha bruta foi a necrose, com uma freqüência pequena de indução de apoptose. O pré-tratamento das células MDCK com catalase, superoxido dismutase e L-NAME inibiu os efeitos sobre morte celular causados pelo peçonha bruta, indicando o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nos danos causados pelo envenenamento pela peçonha de B. alternatus. As peçonhas ofídicas possuem uma grande variedade de enzimas que degradam ácidos nucléicos e seus constituintes. As desoxirribonucleases (DNases) são endonucleases presentes em peçonhas de serpentes que hidrolisam acido desoxirribonucleico (DNA). Sua ação no envenenamento ocorre em conjunto com outras enzimas que quebram ligações fosfato (ATPases, 5¿-nucleotidases, fosfodiesterases, ribonucleases). Vários estudos sobre endonucleases em mamiferos sugerem que a DNase II (DNase acida) seria responsável pela fragmentacao do DNA durante a apoptose. E também conhecido que peçonhas são capazes de induzir apoptose em células. Através de uma combinação de cromatografias de troca iônica, gel filtração, afinidade e HPLC, foi purificada uma DNase da peçonha de B. alternatus, com atividade especifica de 3.489 unidades/mg (atividade especifica da peçonha: 65 unidades/mg) e fator de purificação de ~54 vezes. As características bioquímicas desta enzima são: uma massa molecular de ~31 kDa, ausência de subunidades, pI de 4,4-5,2, pH otimo de atividade de 4,7, termo estabilidade ate 40oC. O Km e Vmax são 10.1 µg/mL e 352.5 U/mg, respectivamente. A enzima degrada preferencialmente DNA de dupla fita, com atividade menor sobre DNA desnaturado; também degrada DNA circular (dos plasmideos pGEM e pBR322) mas não degrada RNA ou poly A. E inibida por altas concentrações (100 mM) de cations (Ca2+, Mg2+ e Zn2+), e também por N-etilmaleimida, iodoacetamida, acido aurintricarboxilico e DTT, mas não por EDTA. A enzima e reconhecida por IgG antibotropica em Western blot e no ELISA e por anti-DNase II humana no Western blot. Em celulas MDCK, a DNase produz alterações morfologicas como vacuolacão do citoplasma, retração e destacamento das celulas em monocamada, presença de núcleos condensados e/ou fragmentados. Através de ensaios de viabilidade e citotoxicidade, verificamos que a DNase e citotoxica as células MDCK em doses a partir de 400 U/mL (~20 µg/mL). Alem disso, causa fragmentação de DNA e um aumento no numero de células apoptoticas, em menor proporção, de células em necrose. A via de apoptose estimulada pela enzima envolve a ativação das caspases 3, 8 e 9, e uma diminuição na expressão da proteína anti-apoptotica Bcl-2. Estes resultados mostram que a peçonha de B. alternatus e citotoxica as células MDCK, com parte desta toxicidade mediada pela DNase II. Esta enzima induz apoptose que poderia contribuir para a toxicidade geral da peçonha (AU)

• Processo FAPESP: 03/01787-2 - Caracterização da DNase da peçonha da serpente Bothrops alternatus: comparação com a DNase ácida de mamíferos envolvida em apoptose
• Beneficiário: Juliana Minardi Nascimento
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto