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Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em E. coli, por evolução dirigida e desenho racional : Produção, purificação, caracterização bioquímica e biofísica da enzima

Texto completo
Autor(es):
Angelica Rodrigues de Souza
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas.
Data de defesa:
Membros da banca:
Roberto Ruller; Gustavo O. Bonilla Rodriguez; Letícia Maria Zanphorlin Murakami; Adriane Maria Ferreira Milagres
Orientador: Roberto da Silva
Resumo

A proposta inicial deste trabalho foi o melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo T. aurantiacus (XynA_Ta), expressada em S. cerevisiae (XynA_Sc), a partir da construção anteriormente obtida em P. pastoris (xynA_Pp). Contudo, a reduzida expressão de XynA_Sc, aliada a duas mutações de aminóacidos, motivaram a reclonagem do gene de xynA_Ta em E. coli (xynA_Ec). O Capítulo 1 descreve o estudo da produção e caracterização de XynA_Sc, XynA_Pp e XynA_Ec, anterior as correções das mutações. Estas exibiram ótimos de expressão com 650, 5,8 e 815 U.mL-1, após 96 h e de atividade em pH 5-5,5 e 65-70 °C. XynA_Ec destacou-se com ampla faixa de estabilidade, de 40 a 85 °C, após 1h, e XynA_Pp mostrou 100% de atividade em pH 6-8, após 24 h. XynA_Sc e XynA_Pp apresentaram forte ativação em solventes orgânicos. A XynA_Sc foi inibida em concentrações superiores a 20 mg.mL-1 de substrato. O Capítulo 2 apresenta resultados da obtenção da forma nativa (corrigida) (XynAc_Ec) e de onze mutantes por MSD. Todas linhagens foram expressas, purificadas e fatores bioquímicos auxiliaram na seleção dos três mais termoresistentes. Estes foram caracterizados, juntamente com XynAc_Ec, frente a fatores biofísicos (CD) e estruturais (por homologia - 1TUXPDB). Destaque para o mutante H209N com maior termoestabilidade, atividade catalítica e Tm de 71,3 °C. O aumento na estabilidade térmica foi relacionado ao incremento de hélices curtas, pontes salinas e a carga positiva no core catalítico (trabalho p... (AU)

Processo FAPESP: 11/22461-4 - Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em e. coli, por evolução dirigida e desenho racional: produção, purificação, caracterização Bioquímica e Biofísica da enzima
Beneficiário:Angelica Rodrigues de Souza
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado