Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em E. coli, por evolução dirigida e desenho racional: Produção, purificação, caracterização bioquímica e biofísica da enzima

Autor(es)

Angélica Rodrigues de Souza

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São José do Rio Preto. 2018-05-25.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas. São José do Rio Preto
• Data de defesa: 2016-03-04
• Orientador: Roberto da Silva; Jeffrey Mertens; Fernando Araripe Gonçalves Torres

Resumo

A proposta inicial deste trabalho foi o melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo T. aurantiacus (XynA_Ta), expressada em S. cerevisiae (XynA_Sc), a partir da construção anteriormente obtida em P. pastoris (xynA_Pp). Contudo, a reduzida expressão de XynA_Sc, aliada a duas mutações de aminóacidos, motivaram a reclonagem do gene de xynA_Ta em E. coli (xynA_Ec). O Capítulo 1 descreve o estudo da produção e caracterização de XynA_Sc, XynA_Pp e XynA_Ec, anterior as correções das mutações. Estas exibiram ótimos de expressão com 650, 5,8 e 815 U.mL-1, após 96 h e de atividade em pH 5-5,5 e 65-70 °C. XynA_Ec destacou-se com ampla faixa de estabilidade, de 40 a 85 °C, após 1h, e XynA_Pp mostrou 100% de atividade em pH 6-8, após 24 h. XynA_Sc e XynA_Pp apresentaram forte ativação em solventes orgânicos. A XynA_Sc foi inibida em concentrações superiores a 20 mg.mL-1 de substrato. O Capítulo 2 apresenta resultados da obtenção da forma nativa (corrigida) (XynAc_Ec) e de onze mutantes por MSD. Todas linhagens foram expressas, purificadas e fatores bioquímicos auxiliaram na seleção dos três mais termoresistentes. Estes foram caracterizados, juntamente com XynAc_Ec, frente a fatores biofísicos (CD) e estruturais (por homologia - 1TUXPDB). Destaque para o mutante H209N com maior termoestabilidade, atividade catalítica e Tm de 71,3 °C. O aumento na estabilidade térmica foi relacionado ao incremento de hélices curtas, pontes salinas e a carga positiva no core catalítico (trabalho publicado). O Capítulo 3 apresenta resultados da combinação in sílico dos três mutantes termoestáveis, com base em dados estruturais (homologia - 1TUX-PDB). Q158R / H209N / N257D exibiu maior conteúdo de interações salinas e menor RMSF. Portanto, XynA_Pp, XynA_Ec e H209N são enzimas potenciais para aplicação em bioprocessos; e estudos in sílico sugerem que mutante Q158R / H209N / N257D seja obtido in situ. (AU)

• Processo FAPESP: 11/22461-4 - Melhoramento da termoestabilidade da xilanase do fungo Thermoascus aurantiacus, expressa em E. coli, por evolução dirigida e desenho racional: Produção, purificação, caracterização bioquímica e biofísica da enzima.
• Beneficiário: Angelica Rodrigues de Souza
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado