Aplicação de ferramentas proteômicas e metaloproteômicas na caracterização de biomarcadores plasmáticos e hepáticos de ratos submetidos ao diabetes tipo 1

Autor(es)

Camila Pereira Braga

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Botucatu. 2016-08-26.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. Botucatu
• Data de defesa: 2016-07-21
• Orientador: Pedro de Magalhães Padilha; Ana Angélica Henrique Fernandes

Resumo

Diabetes mellitus tipo 1 é caracterizado pelo aumento significativo de glicose circulante no sangue, resultado da deficiência na secreção e/ou ação de insulina. O quadro hiperglicêmico, quando cronicamente instalado, leva a anormalidades no metabolismo de lipídios, proteínas e carboidratos, além de alterar o balanço entre pró-oxidantes e antioxidantes. É um importante problema de saúde pública, pois compromete a qualidade de vida e sobrevida dos indivíduos, além de envolver elevados custos no seu tratamento. Quando se consegue identificar os fatores determinantes para o desenvolvimento do diabetes, novas estratégias de prevenção e tratamento são necessárias. Nesse contexto, as proteínas e os minerais apresentam fundamental importância como componentes estruturais e funcionais dos seres vivos. Estudos proteômicos e metaloproteômicos, auxiliam na compreensão da variabilidade do diabetes, contribuindo assim na elucidação dos aspectos fisiológicos e funcionais das biomoléculas presentes em amostras biológicas, como plasma e tecido animal, além disso, a possível identificação de biomarcadores relacionados ao desenvolvimento de doenças crônicas degenerativas, como o diabetes. O objetivo geral do trabalho foi utilizar ferramentas proteômicas e metaloproteômicas na identificação de possíveis biomarcadores presentes no plasma e fígado de ratos diabéticos tipo 1 induzido experimentalmente com estreptozotocina. Foram utilizados 24 ratos Wistar, distribuídos em 3 grupos experimentais (n= 8): C (controle); DM1 (diabéticos tipo 1); DM1 + I (diabéticos tipo 1, tratadas com insulina). O diabetes mellitus tipo 1 foi induzido com estreptozotocina (60mg/kg, i.p., dose única) e os animais do grupo DM1 + I receberam reposição insulínica (Humulin N100UI Protamina Neutra de Hagedorn - NPH, marca Lilly), com dose inicial de 3U/animal (administrada diariamente, via subcutânea, período vespertino) e de acordo com os valores obtidos de glicemia a dose inicial foi reajustada/mantida para que se atingissem os níveis séricos de euglicemia. No plasma, foi realizado estudo metaloproteômico para as proteínas que apresentaram diferença de expressão entre os grupos experimentais, utilizando-se a 2D-PAGE no processo de fracionamento de proteínas das amostras de plasma, GFAAS e FAAS na determinação quantitativa de Cu, Mg, Se e Zn nos spots que apresentaram diferença de expressão e ESI/MS-MS na caracterização dessas proteínas. Trinta e cinco proteínas apresentaram diferença de expressão no plasma, indicando a alpha-1-macroglobulina e haptoglobulina como possíveis biomarcadoras do diabetes tipo 1 controlado (tratado com insulina); e as proteínas 2'-desoxinucleósido-5'-fosfato de N-hidrolase 1, proteína transmembranar 1, soro amilóide P-componente, vitamina D de ligação e biliverdina como possíveis candidatas a biomarcadoras do diabetes tipo 1 não controlado. Já a quantificação de Cu, Mg, Se e Zn nos spots revelaram como esses minerais poderiam estar ligados nessas proteínas e como estariam envolvidos na expressão proteica, progressão e complicações do diabetes tipo 1. No fígado, primeiramente foi realizado estudo proteômico, onde as proteínas foram caracterizadas pela técnica de gel-free e classificadas como dependentes ou independentes de insulina (tratamento), em relação aos dados obtidos para abundância e diferença de expressão. Esse estudo identificou 305 proteínas com diferença de expressão entre os grupos experimentais, entre elas 147 foram classificadas como dependentes de insulina e 152 como independentes de insulina. O controle dos níveis de glicose sanguínea pelo tratamento com insulina, restaurou os níveis da enzima frutose-1,6 bifosfatase indicando controle da gliconeogênese, e afetou a abundância das enzimas que funcionam na desintoxicação de EROs, restaurando o equilíbrio redox e a função mitocondrial. No fígado também foi feito o estudo das proteínas diferencialmente expressas pelo Oxi-proteoma, utilizando a 2D-DIGE com os fluoróforos Cy3 e Cy-5-hidrazida no processo de fracionamento e caracterização dos spots proteicos por ESI-MS/MS. A identificação das proteínas carboniladas indicou que o tratamento com insulina está associado com a diminuição do estresse oxidativo por meio da regulação positiva das enzimas antioxidantes e diminuição da produção de EROs, controle das vias metabólicas envolvidas com o metabolismo de carboidratos (glicólise e gliconeogênese) e metabolismo energético. Estudo metaloproteômico também foi realizado no fígado, utilizando a 2D-PAGE no processo de fracionamento de proteínas, GFAAS e FAAS na determinação quantitativa de Cu, Mg, Se e Zn nos spots obtidos no fracionamento das proteína e caracterização das proteínas por ESI/MS-MS. Os resultados obtidos nesse estudo sugeriram diferentes interações entre os minerais estudados e as proteínas entre os grupos experimentais. Essas interações podem estar associadas com alterações funcionais nessas proteínas e envolvimento na progressão e complicações do diabetes tipo 1. Assim, as informações obtidas no presente trabalho fornecem subsídios técnico-científicos na área de saúde de extrema importância, possibilitando o entendimento dos dados proteômicos e metaloproteômicos gerados relacionados com suas respectivas vias metabólicas, função molecular, processo biológico e componente celular. O caráter inédito da proposta proporcionou a elucidação de aspectos fisiológicos e funcionais das biomoléculas presentes em amostras biológicas, como plasma e tecido hepático. (AU)

• Processo FAPESP: 11/21672-1 - Aplicação de ferramentas proteômicas e metaloproteômicas na caracterização de biomarcadores plasmáticos e hepáticos de ratos submetidos ao diabetes tipo 1
• Beneficiário: Camila Pereira Braga
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado