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Ensaio enzimático on-line baseado em enzimas imobilizadas e cromatografia zonal para identificação e caracterização de inibidores da enzima Nucleosídeo Difosfato Quinase B

Texto completo
Autor(es):
Juliana Maria de Lima
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: Ribeirão Preto.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
Data de defesa:
Membros da banca:
Carmen Lúcia Cardoso; Emanuel Carrilho; Quezia Bezerra Cass; Maria Cristina Nonato; Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira
Orientador: Carmen Lúcia Cardoso
Resumo

As enzimas desempenham papel fisiológico fundamental nos organismos, seja em condições normais e patológicas, o que as tornam atrativos alvos para intervenções terapêuticas. Pequenas moléculas capazes de inibir enzimas alvos são utilizadas para o tratamento de diversas doenças inflamatórias, câncer, AIDS, entre outras. Contudo, a identificação de pequenas moléculas inibidores ainda é uma etapa limitante no desenvolvimento de fármacos. Nesse contexto, o aprimoramento e novos ensaios robustos e confiáveis para acelerar a descoberta e a caracterização de novos inibidores é de extrema relevância. Nesta tese apresentamos o desenvolvimento de apropriados métodos para a quantificação direta da atividade das enzimas alvos Nucleosídeo Difosfato Quinase B (NDKb), humana (NME2) e de Leishmania major (LmNDKb), livres em solução ou imobilizadas em colunas capilares (ICER). A separação dos produtos e substratos da reação foi realizada por cromatografia de par iônico, que possibilitou a quantificação direta da atividade enzimática da NDKb livre em solução, método 1D-LC-UV. Já para a quantificação da atividade das enzimas imobilizadas foi elaborado um método on-line ICER-LC-UV, no qual a reação enzimática do ICER foi transferida à coluna analítica, permitindo a separação e quantificação da atividade de fosfotransferência. Utilizando esses métodos foi possível determinar o pH ótimo e os parâmetros cinéticos das enzimas livres e imobilizadas. Inibidores de NDKb de diferentes potências e mecanismos de ação foram utilizados para modulação do sistema ICER-LC-UV como ensaio de triagem de inibidores. O (-)-Epicatequina galato (ECG) foi utilizado como prova de conceito, para validar a aplicação do método on-line ICER-LC-UV na identificação e caracterização de inibidores para as enzimas alvo NME2 e LmNDKb. Em suma, a quantificação direta associada ao uso de enzimas imobilizadas representa um grande avanço aos métodos consolidados para o monitoramento da atividade enzimática e triagem de inibidores das enzimas alvo. (AU)

Processo FAPESP: 14/06907-0 - Imobilização da enzima nucleosídeo difosfato quinase (NDK) de Leishmania major: do estudo de condições à aplicação na triagem de ligantes
Beneficiário:Juliana Maria de Lima
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto