Modulação epigenética de células mesenquimais após o tratamento com o inibidor de DNA metiltransferase

Autor(es)

Rahyza Inacio Freire de Assis

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Piracicaba, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba
• Data de defesa: 2017-02-17

Membros da banca

Denise Carleto Andia; Rodrigo Augusto da Silva; Karina Gonzales Silverio

• Orientador: Denise Carleto Andia

Resumo

Introdução: As células mesenquimais indiferenciada da medula óssea (CMIMO) são consideradas fonte promissora para terapia celular, embora sua regulação epigenética não seja totalmente compreendida. O RG108 bloqueia o sítio ativo das enzimas que metilam o DNA, as DNA-metiltransferases (DNMTs). Objetivo: Melhor compreender a biologia básica das CMIMO e efeitos do RG108 e da consequente inibição das DNMTs, nas modificações epigenéticas globalmente e em genes específicos da maquinaria epigenética. Além disso, foram avaliados genes envolvidos na manutenção do estado multipotente das CMIMO. Métodos: As células foram distribuídas em grupos e tratadas durante 3 dias: DMEM ¿ células cultivadas em meio de cultura padrão; Dimetilsulfóxido (DMSO/veículo do RG108) ¿ células cultivadas em DMEM+DMSO; RG108 ¿ células cultivadas em DMEM+RG108 (50µM) e os efeitos foram testados, avaliando-se viabilidade, tempo de duplicação e apoptose celular. A metilação/hidroximetilação global, atividade das desmetilases e das DNMTs e níveis da proteína DNMT1 foram avaliados por ensaios colorimétricos. Os níveis de transcritos dos genes DNMT1, Ten-eleven-translocation-(TET) -1 e POU5F1-POU-class-5-homeobox-1-(OCT4) foram quantificados pela reação em cadeia da polimerase (qPCR) e os níveis de metilação/hidroximetilação dos genes DNMT1, DNMT3B e NANOG-Homeobox (NANOG) foram avaliados por qPCR, precedidos pela glicosilação da 5-hidroximetilcitosina e digestão com enzimas de restrição. Resultados:O RG108 não reduz a viabilidade celular ou induz a morte celular por apoptose e não afeta a taxa de proliferação celular. Globalmente, o RG108 diminui a metilação do DNA (p ? 0,05), sem modulação dos níveis de hidroximetilação. Houve diminuição na atividade das DNMTs para os grupos DMSO e RG108, comparados ao grupo DMEM (p ? 0,05); antagonicamente, houve aumento na atividade das desmetilases para os grupos DMSO e RG108, em comparação ao DMEM (p ? 0,05), sem mudança nos níveis da proteína DNMT1. Os níveis de RNAm para o gene DNMT1 foram reduzidos para os grupos DMSO e RG108 (p ? 0,05) e o grupo tratado com RG108 apresentou níveis aumentados de RNAm para os genes TET1 (p ? 0,05) e OCT 4 (p ? 0,05), comparando-se ao DMEM. Não houve modulação nos níveis de metilação/hidroximetilação do gene DNMT1. Entretanto, um aumento nos níveis de metilação do gene DNMT3B foi observado nos grupos DMSO e RG108, comparados ao DMEM (p ? 0,05), sem modulação nos níveis de hidroximetilação. Em contrapartida, o gene NANOG respondeu diminuindo os níveis de hidroximetilação do DNA para o grupo RG108 (p ? 0,05), sem modulação nos níveis de metilação do DNA. Conclusão: O RG108 é um agente desmetilante seguro, capaz de modular a atividade das DNMTs e desmetilases, nas CMIMO. Essa modulação estimulou mudanças globais no DNA e em transcritos de genes específicos. Entretanto, não houve modulação para o gene ou a proteína DNMT1, embora tenha sido observada para o gene DNMT3B e também para o gene NANOG, modulado em seus níveis de hidroximetilação. O modulador epigenético RG108 e a consequente inibição da DNMT1 promovem mudanças nos genes da maquinaria epigenética e em genes relevantes para a manutenção das CMIMO em estado indiferenciado. Interessantemente, o DMSO também desencadeou modulação, entretanto, esta modulação foi restrita aos genes da maquinaria epigenética (AU)

• Processo FAPESP: 15/02160-0 - Desmetilação de células mesenquimais indiferenciadas da medula óssea de humanos: regulação epigenética
• Beneficiário: Rahyza Inacio Freire de Assis
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado