Atividade antiproliferativa in vitro da coronarina D

Autor(es)

Márcia Yumi Okubo

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Piracicaba, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba
• Data de defesa: 2016-04-13

Membros da banca

João Ernesto de Carvalho; Luiz Eduardo Nunes Ferreira; Denise Gonçalves Priolli

• Orientador: João Ernesto de Carvalho

Resumo

Este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antiproliferativa da coronarina D, em painel de células tumorais humanas composto por dez linhagens, através do método de sulforrodamina B. Entre essas linhagens, a de glioblastoma (U251) foi uma das que apresentou maior seletividade, e por isso foi selecionada para os estudos de morte celular e controle do ciclo celular utilizando citometria de fluxo. Após avaliação da viabilidade celular, na qual as células de U251 foram tratadas com diferentes tempos e concentrações, foram determinadas as condições de tratamento empregadas nas análises de citometria de fluxo. Foram escolhidas as concentrações não tóxicas de 2,5 µM; 5 µM e 10 µM e os tempos de 24 e 48 horas para quantificação do DNA nas fases G1, S e G2/M com iodeto de propídio, enquanto que na avaliação de morte celular envolvendo exposição de resíduos de fosfatidilserina (marcação pela anexina V-PE), foram selecionados os tempos de exposição de 12 e 24 horas, nas concentrações de 10, 20 e 40 µM de coronarina D (viabilidade celular de 70% a 80%). Em seguida, foram realizados os ensaios de: ativação de caspases utilizando o fluoróforo SR-VAD-FMK, perda de potencial de membrana mitocondrial indicada pela redução da fluorescência da rodamina 123 e liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) dosada através da fluorescência de DCF. Os resultados indicaram que a coronarina D na concentração de 10 µM, alterou a cinética do ciclo celular com acúmulo na fase G1 após 24 e 48 horas de exposição. Além disso, foi observada a sinalização para processo de morte através da exposição da fosfatilserina nas concentrações testadas em 12 e 24 horas de tratamento. Nas concentrações de 20 e 40 µM, após 24 horas de tratamento houve ativação de caspases com redução do potencial de membrana mitocondrial observado em 6, 9 e 12 horas que foi ocasionada pela liberação da H2O2, uma espécie reativa de oxigênio, após 1 hora e 30 minutos de tratamento. Nesses testes foram utilizadas a análise de variância de duas vias (ANOVA), com nível de significância p<0,05. Adicionalmente, foi realizada uma avaliação preliminar de segurança do tratamento com a coronarina D através do teste de indução de micronúcleo na linhagem de ovário de hamster chinês (CHO-K1) nas condições de ausência e presença de enzimas de metabolização humana (fração S9). Sendo notada uma alta frequência de micronúcleo na concentração de 10 µM que foi reduzida na presença de enzimas de metabolização da fração S9. Esses resultados foram submetidos à análise de variância de uma única via (ANOVA), seguida de Teste de Tukey (p<0,05). Portanto, sugere-se que a coronarina D foi capaz de induzir a parada das células U251 no ponto de checagem entre a fase G1 e S, de conduzi-las à morte celular pelo mecanismo de apoptose intrínseca, iniciado por um estresse originado da liberação de H2O2 que conduz à redução do potencial de membrana mitocondrial e à ativação de caspases, e de interagir com o DNA causando maiores danos ao material genético sem a fração S9 (AU)

• Processo FAPESP: 14/06636-7 - Atividade antiproliferativa in vitro da Coronarina-D
• Beneficiário: Márcia Yumi Okubo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado