Emprego de células tronco embrionárias humanas com superexpressão de FGF2 após avulsão de raízes ventrais medulares: neuroproteção e imunomodulação

Autor(es)

Marta Rocha Araujo

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-10-14

Membros da banca

Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira; Rosalia Mendez Otero; Angela Cristina Malheiros Luzo; Daniel Martins de Souza; Betania Souza Monteiro

• Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira

Resumo

Avulsão de raízes ventrais (VRA) é uma lesão proximal de motoneurônios medulares na interface do sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP). Tal lesão desencadeia uma cascata de eventos celulares e moleculares que leva à degeneração retrógrada de cerca de 80% dos motoneurônios axotomizados, duas semanas após a lesão. Assim, a VRA tem se mostrado um modelo experimental reprodutível de degeneração de neurônios motores em modelos animais. Diversos trabalhos têm mostrado os benefícios da terapia celular, utilizando células tronco, na neuroproteção sobre os motoneurônios lesados e, consequentemente, no aumento da sobrevivência neuronal. Outros estudos têm mostrado que a terapia com o fator de crescimento de fibroblastos -2 (FGF2) estimula a neurogênese e a plasticidade sináptica em modelos de doenças neurodegenerativas. O presente estudo teve por objetivo conjugar o uso de células tronco com a entrega local do FGF2, avaliando seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios medulares em ratos Lewis após avulsão de raízes motoras. Além disso, investigou-se a eficácia do uso de selante de fibrina como arcabouço capaz de reter as células enxertadas no sítio da lesão. Para isso foram produzidas, por bioengenharia, linhagens derivadas de células tronco embrionárias humanas que superexpressam FGF2 humano de modo induzido, através da doxiciclina, contendo a proteína fluorescente verde como marcador (hES-FGF2-GFP). Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais: Grupo 1- avulsão de raízes motoras + selante de fibrina; Grupo 2- avulsão de raízes motoras + selante de fibrina + injeção de hES-FGF2-GFP + doxiciclina; Grupo 3- avulsão de raízes motoras + selante de fibrina + doxiciclina; Grupo 4- avulsão de raízes motoras + selante de fibrina + injeção de hES-FGF2-GFP; Grupo 5- avulsão de raízes motoras + selante de fibrina + FGF2; Grupo 6- Avulsão; Grupo 7 ¿ Sem lesão. Após sobrevida de 14 dias foram analisados (1) a expressão de sinaptofisina (marcador de sinapses), de GFAP (marcador de astrócitos) e Iba-1 (reação microglial), através da técnica de imunohistoquímica; (2) a produção dos fatores neurotróficos BDNF e GDNF pelas hESC; (3) sobrevivência de neurônios motores medulares, através da técnica de coloração de Nissl e posterior análise quantitativa (esteriológica) ao microscópio de luz; (4) através do uso de qRT-PCR, a expressão de marcadores da resposta inflamatória, incluindo TNF-? e interleucinas IL1?, IL-6 IL-10, bem como os fatores BDNF e GDNF. Os resultados mostraram que o tratamento com hESC induzidas para superexpressar FGF2 aumentou a sobrevivência neuronal em 23%. A avaliação imunoistoquímica com sinaptofisina mostrou que nos grupos II e V, tratados com as hESC + doxiciclina e FGF2 respectivamente, houve redução significativa da perda de terminais em aposição ao corpo celular, refletindo uma possível diminuição do processo de eliminação sináptica. Além disso, houve também diminuição significativa da marcação anti-GFAP (astrogliose reativa) no grupo tratado com hESC + doxiciclina, em relação aos outros grupos. Um importante achado foi que as hESC-GFP superexpressando FGF2, produziram BDNF no sítio de injeção das células e co-expressaram GDNF na região perimedular. No entanto, a terapia celular com as hESC e FGF2 não produziu diferenças significativas em relação à reação microglial. O grupo tratado com FGF2 apresentou maior expressão da ?2µ e o grupo tratado com hESC + doxiciclina apresentou menor expressão de TNF-? e maior expressão de IL-10, indicativo de microambiente anti-inflamatório. Em conjunto, os presentes resultados apontaram para um efeito neuroprotetor das células tronco embrionárias humanas modificadas para superexpressar FGF2, além de preservação sináptica e diminuição da astrogliose, podendo esses resultados levar a promissores estudos regenerativos, visando melhorar a recuperação motora após lesões do plexo braquial e lombosacral (AU)

• Processo FAPESP: 13/23030-2 - Emprego de células tronco embrionárias humanas com superexpressão de FGF2 após avulsão de raízes ventrais medulares: neuroproteção e imunomodulação
• Beneficiário: Marta Rocha Araujo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado