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Investigação dos determinantes estruturais do modo de ação de endo e exo-arabinanases provenientes da microflora do rúmen bovino

Texto completo
Autor(es):
Carla Cristina Polo
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Celso Eduardo Benedetti; Jörg Kobarg; Marcos Roberto Mattos Fontes; Hamilton Cabral
Orientador: Mário Tyago Murakami
Resumo

A parede celular vegetal é composta por um complexo polissacarídico junto a proteínas estruturais capazes de conter e comprimir todos as organelas citoplasmáticas. Dentre seus componentes estão polímeros tais como a celulose, hemicelulose, pectina e lignina. Para tanto, a natureza usufrui de uma grande diversidade de enzimas especializadas na formação e degradação desses açúcares complexos, as chamadas CAZymes (do inglês, Carbohydrate-Active enZymes) e classificadas em famílias de acordo com sua estrutura primária e enovelamento. As hidrolases glicosídicas (GHs) estão entre as CAZymes mais abundantes, representadas por 135 famílias. Dentre elas, a família GH43, apresenta-se poliespecífica com uma variedade de atividades (ECs), tais como arabinanase (EC 3.2.1.99). Entretanto, são escassos os estudos estruturais a fim de elucidar os mecanismos de degradação e regulação destas enzimas. Seus substratos, as arabinanas, são a segunda pentose mais abundante presente na parede vegetal e tem considerável valor comercial na indústria alimentícia e de degradação da biomassa. Portanto, o presente estudo teve como alvo a caracterização estrutural e bioquímica de duas novas arabinanases, uma endo-?-1,5-L-arabinanase (ARN2) e uma exo-?-1,5-L-arabinanase (ARN3) extraídas da microflora do rúmen bovino e que apresentaram propriedades funcionais únicas em relação as suas homólogas. A resolução das estruturas por cristalografia de raios X revelou o enovelamento canônico da família GH43, 5-fold ?-propeller, com conservação dos resíduos catalíticos que participam de um mecanismo de catálise por inversão do carbono anomérico. Pela caracterização da enzima ARN2, foi possível verificar que sua interface catalítica é extremamente acessível ao solvente e volumosa, explicando assim, sua preferência por substratos ramificados e contrastando com as homólogas de interfaces mais estreitas que permitem principalmente a acomodação de substratos lineares. A enzima ARN3 apresentou, também, características peculiares quanto ao seu mecanismo de ação envolvendo o reconhecimento da extremidade redutora do polímero para liberação de arabinose. Esta região encontra-se parcialmente bloqueada por um longo e divergente loop (R203-A230). Para confirmar o papel desta região no modo de ação da enzima, uma quimera foi desenhada e o longo segmento foi substituto pela sequência SRGEEP, conservada em endo-arabinanases da família. Como predito, a enzima quimérica adquiriu propriedades de uma endo-enzima gerando arabinobiose, majoritariamente. Interessantemente, as análises estruturais permitiram verificar o papel do domínio acessório na estabilização da fenda de ligação ao substrato em enzimas compostas por dois domínios, como ARN2. Em enzimas que compreendem um único domínio, como ARN3, a região é estabilizada por duas cisteínas adjacentes que formam uma ponte dissulfeto. Além disso, foi observado que estas enzimas não possuem um mecanismo regulatório cálcio-dependente, um comportamento inédito na família GH43. Por fim, este trabalho contribuiu coletivamente com novas estratégias para degradação da fração hemicelulósica/péctica da biomassa vegetal e expande o atual conhecimento a respeito da família GH43. Dentro dos elementos pós-textuais desta tese está o artigo I, referente aos resultados obtidos na tese, além dos artigos II e III que consistem de colaborações. No anexo IV consta um breve resumo a respeito dos trabalhos realizados durante o doutorado sanduiche na VTT Technical Research Centre of Finland (AU)