BMyb e a resposta das células epiteliais prostáticas às variações nos níveis de testosterona

Autor(es)

Rafaela Rosa Ribeiro

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-08-25

Membros da banca

Hernandes Faustino de Carvalho; Sérgio Luis Felisbino; Eduardo Moraes Rego Reis; Murilo Vieira Geraldo; Leticia Fröhlich Archangelo

• Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho

Resumo

Neste trabalho definimos a expressão e localização de fatores de transcrição que agem no controle de genes diferencialmente expressos na próstata ventral de ratos na ausência do andrógeno. Na primeira etapa, utilizamos análises de microarranjos de DNA, bioinformática e identificamos genes com função de reguladores da transcrição: EVI1 (Mecom), NFY, ELK1, GATA2, MYBL1, MYBL2 (BMYB), e membros da família NF?B que foram validados por imunofluorescência e qRT-PCR (Rosa-Ribeiro, Nishan, et al., 2014). Na segunda etapa, procuramos caracterizamos Bmyb na próstata ventral de ratos após a castração e também BMYB e em linhagens celulares humanas. Vimos que a expressão de Bmyb teve um aumento de cinco vezes no conteúdo relativo de RNAm e presença da sua forma ativa (fosfo-T487-BMYB) no núcleo das células epiteliais de próstata ventral de ratos três dias após a castração. Identificamos que as células LNCaP (células epiteliais de câncer de próstata humanas) expressam BMYB e as escolhemos para testar como o estímulo androgênico modula a expressão, ativação e interação de BMYB com o genoma/cromatina. Células LNCaP foram tratadas com R1881 (andrógeno sintético) 1 nM ou veículo (DMSO) por 6, 12 e 24 horas. Observou-se que o tratamento com R1881 por 12 horas resultou em diminuição da expressão de BMYB (qRT-PCR), e também em redução da forma fosforilada em T487 (Western Blotting), embora tenha o conteúdo aumentado ao longo do ciclo celular e acúmulo acentuado durante a mitose (imunofluorescência). Dupla marcação por imunofluorescência revelou que a ativação de AR por R1881 resulta em seu acúmulo no núcleo promove exclusão de fosfo-T487-BMYB. Para investigar aspectos da interação entre BMYB com cromatina de células LNCaP, submetemos o grupo de 12h tratado com R1881 e o grupo controle a técnica de ChIP-seq. As regiões de ligação de BMYB (picos) identificadas apresentaram características distintas e similares entre os dois grupos experimentais. Como imaginado, o motivo de ligação para BMYB foi encontrado enriquecido nas duas condições, porém, no grupo controle foi localizado também uma seqüência não-canônica para BMYB. Além dos motivos para BMYB, foram encontrados motivos de ligação enriquecidos para SMAD2, STAT5, STAT6 e ZFX nos dois grupos enquanto NKX2.5 e ZNF711 exclusivamente nos grupos controle e R1881, respectivamente. A presença dos motivos para BMYB nos picos, possui uma distribuição que respeita a "lei de potência" mostrando que picos com mais motivos de ligação são regiões bastante grandes e localizadas próximas ao TSS dos genes mais próximo sugerindo a formação de "campos de atividade". Considerando somente a região próxima ao TSS, há uma frequência maior de picos no grupo R1881. Com relação presença de BMYB nos cromossomos, ele tem uma distribuição similar nos dois grupos e preferencia pela região centromérica. Os genes com TSS mais próximo aos picos de BMYB, são em sua maioria "genes codificadores de proteínas" nos dois grupos. Já a respeito das regiões no genoma a localização de picos é preferencialmente em regiões "intergênicas" com exclusividade de regiões para R1881 em regiões "5¿UTR", "3¿UTR" e "Exon" dos genes. As ontologias que esses genes configuram (10 vs 55, para controle e R1881, respectivamente) são distintas para as duas condições experimentais e se referem a funções variadas considerando "biological process". Além disto, comparando os genes encontrados pelo ChIP-seq com transcriptomas da literatura, encontramos que 5% dos genes são os mesmos pelas duas abordagens e que genes como KLK3, KLK2, TMSRPS22 e NKX2.5 relacionados a biologia da próstata, estão presentes no grupo R1881. Em conclusão, os resultados obtidos são inéditos e demonstram que BMYB executa funções compatíveis com a regulação diferencial da estrutura da cromatina em diversas escalas, nos estados androgênico e hipoandrogênico (AU)

• Processo FAPESP: 12/07512-4 - Expressão gênica sequencial em resposta à privação androgênica: orquestrando atividade secretora, proliferação e morte celular na próstata ventral de ratos
• Beneficiário: Rafaela da Rosa Ribeiro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado