Texto completo
| |
| Autor(es): |
Giovana Maria Breda Veronezi
Número total de Autores: 1
|
| Tipo de documento: | Dissertação de Mestrado |
| Imprenta: | Campinas, SP. |
| Instituição: | Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia |
| Data de defesa: | 2017-02-24 |
| Membros da banca: |
Maria Luiza Silveira Mello;
Alberto da Silva Moraes;
Daniel Pacheco Bruschi
|
| Orientador: | Maria Luiza Silveira Mello; Benedicto de Campos Vidal |
| Resumo | |
O ácido valproico (VPA) é um antiepiléptico de uso bem estabelecido que também é reconhecido como inibidor de deacetilases de histonas (HDAC), induzindo hiperacetilação de histonas H3 e H4. Adicionalmente, tem sido sugerido papel do VPA na demetilação do DNA em diversos tipos celulares, possivelmente de maneira ativa e independente do processo de replicação. O presente trabalho estudou os efeitos do VPA sobre a abundância de 5-metilcitosina (5mC) e elementos das vias de demetilação do DNA em células HeLa, comparado à ação da droga de conhecida ação demetilante, 5-aza-2¿-deoxicitidina (5-aza-CdR). Foi também investigada a possível contribuição da ação demetiladora do DNA pelo VPA na remodelação da cromatina previamente atribuída à inibição de HDAC neste tipo celular, bem como os impactos de possíveis alterações induzidas pelo VPA nas marcas de 5mC sobre o perfil espectral do DNA ao infravermelho. Em células tratadas com VPA e 5-aza-CdR, os níveis de metilação do DNA foram avaliados por imunocitoquímica e ELISA. Os derivados da citosina 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-carboxilcitosina (5caC) e 5-formilcitosina (5fC) foram investigados por imunocitoquímica. Em paralelo, PCR quantitativo em tempo real foi realizado para acessar informações a respeito dos níveis de expressão gênica da DNA metiltransferase 1 (DNMT1) e de enzimas da família das ten-eleven-translocation (TET), TET1 e TET2, além de Western blotting para medir os níveis proteicos de DNMT1 e TET2. Ensaios ao microespectrofotômeto de varredura foram realizados a fim de constatar alterações na supraorganização cromatínica de células HeLa tratadas com VPA e perfis espectrais do DNA foram obtidos por microespectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR). Foi comprovada a indução de hipometilação do DNA pelo VPA em células HeLa, semelhante ao observado em tratamentos com a 5-aza-CdR. A redução nos níveis de 5mC concomitante a um efeito de descompactação cromatínica pelo VPA nestas células persistiram por 24 h na ausência da droga, porém não por 48 h, demonstrando papel da metilação de DNA em eventos de remodelação da cromatina, com efeitos de longa duração. A demetilação observada em resposta ao VPA também influenciou os perfis espectrais do DNA no infravermelho, afetando mais significativamente os picos relacionados a vibrações de estiramento simétrico e antissimétrico do grupamento metil da 5mC. Tanto os tratamentos com VPA quanto com a 5-aza-CdR não alteraram as marcas de 5caC e 5fC mas foram capazes de aumentar os níveis de 5hmC, enquanto as enzimas estudadas (DNMT1, TET1 e TET2) apresentaram resposta diferencial a estas drogas. Foi assim reforçada a influência do VPA e da 5-aza-CdR sobre vias ativas de demetilação do DNA e demonstrado que estas drogas atuam por meio de mecanismos distintos. Em conjunto, foi possível obter maiores informações a respeito da ação do VPA sobre a metilação de DNA em células HeLa, permitindo comparações dos efeitos desta droga sobre outras linhagens tumorais agressivas. Também foi possível estabelecer um paralelo entre a ação epigenética do VPA com a de outro composto, a 5-aza-CdR, e assim ter maior conhecimento dos mecanismos de ação destas drogas amplamente utilizadas (AU) | |
| Processo FAPESP: | 14/23842-0 - A metilação do DNA em células HeLa após tratamento com ácido valpróico |
| Beneficiário: | Giovana Maria Breda Veronezi |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Mestrado |