Investigação da formação de inflamassoma em pacientes com anemia falciforme

Autor(es)

Rafaela Mendonça Baggio

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2019-03-08

Membros da banca

Nicola Amanda Conran Zorzetto; Fabíola Traina; Erich Vinicius De Paula; Alessandra Gambeiro; Vanessa Moreira

• Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto

Resumo

A hemoglobinopatia, anemia falciforme (AF), apresenta uma fisiopatologia complexa que resulta num estado inflamatório crônico, fundamental para o início e propagação dos processos vaso-oclusivos associados à doença, bem como muitas das suas variáveis manifestações, como a síndrome torácica aguda, hipertensão pulmonar, AVC e nefropatia. Acredita-se que o estado inflamatório crônico da AF seja resultado de processos de hemólise intravascular e de isquemia/reperfusão; por sua vez, o processo vaso-oclusivo é desencadeado pela adesão dos glóbulos vermelhos e leucócitos ao endotélio da microcirculação, formando uma barreira física para o sangue. Atualmente, o tratamento da AF é limitado à terapia de transfusão de eritrócitos, transplante de células tronco-hematopoiéticas e alguns farmacoterápicos (como a hidroxiureia) que mostram eficácia em pacientes AF. Acreditamos que a formação de estruturas do inflamassoma nos leucócitos de indivíduos com AF possa contribuir de forma significativa para o seu estado inflamatório. O inflamassoma é um complexo proteico multimérico formado em células inflamatórias, sendo constituído muitas vezes por uma molécula sensora, (como a NLRP3), uma proteína adaptadora, denominada ASC (Apoptosis associated speck like protein containing a CARD), e a caspase-1 (inflamassoma clássico). A formação do inflamassoma pode ser estimulada por uma série de moléculas liberadas durante um processo infeccioso ou durante danos teciduais/desequilíbrios metabólicos; estas moléculas são conhecidas como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs), respectivamente. Este projeto teve como objetivo comprovar (ou não) a existência da formação de inflamassoma nos neutrófilos e monócitos de indivíduos com AF, bem como identificar os componentes deste complexo e os possíveis DAMPs que podem contribuir para a sua formação nesta doença. As técnicas utilizadas para este estudo foram: ELISA, citometria de Fluxo, imunofluorescência e microscopia confocal, citometria de fluxo com imagem, PCR quantitativo (PCRq), Western blotting, co-imunoprecipitação, cultura de células primarias e de linhagem, clonagem de plasmídeos, ensaios de transfecção e a técnica de Bimolecular fluorescence complementation. Concentrações circulantes de IL-1? e IL-18 foram encontradas significativamente elevadas na população de pacientes com AF estudada. Além disso, apresentamos dados inéditos que indicam que neutrófilos de indivíduos AF (neutrófilos AF) liberam IL-1? em uma quantidade aumentada, quando comparado a neutrófilos de indivíduos sadios. No entanto, de forma interessante, o processamento dessa citocina nos neutrófilos AF foi dependente da atividade aumentada de caspase-1, mas não da participação do sensor NLRP3 ou da molécula ASC. Assim sendo, sugerimos que o processamento de IL-1? por neutrófilos em indivíduos AF não é mediado pela formação clássica do inflamassoma NLRP3. Em monócitos de indivíduos AF, observamos o processamento e liberação de IL-1? e IL-18, mas não encontramos diferenças significativas na sua liberação para o meio extracelular em comparação aos monócitos de indivíduos sadios. No entanto, dado o número aumentado desses leucócitos na circulação de indivíduos AF, não podemos excluir a participação dos monócitos nas concentrações elevadas de IL-1? e IL-18 observadas na AF. Evidências indicam que este inflamassoma, formado em monócitos AF, é mediado pela forma clássica do inflamassoma NLRP3 e necessita do recrutamento da molécula ASC para ativação de caspase-1. DAMPs são significativamente aumentados no meio circulante em indivíduos AF; demonstramos também que o plasma de indivíduos AF é capaz de estimular a formação do inflamassoma em neutrófilos e, mais importante, é capaz de ativar a maquinaria inflamatória em células não imunes transfectadas. Esses achados são importantes para o aprimoramento da nossa compreensão da fisiopatologia da AF, uma vez que mecanismos que induzem o processamento da IL-1? amplificam as respostas inflamatórias e podem representar importantes alvos terapêuticos para a doença (AU)

• Processo FAPESP: 16/08729-8 - Investigação da formação de inflamassoma em pacientes com anemia falciforme
• Beneficiário: Rafaela Mendonça Baggio
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto