Avaliação das técnicas moleculares de DNA microarray e LAMP para a identificação das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii de isolados crescidos em meio de cultura e de líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite

Autor(es)

Pamella Stivanelli

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2019-01-30

Membros da banca

Maria Luiza Moretti; Celia Regina Garlipp; Gilda Maria Barbaro Del Negro

• Orientador: Maria Luiza Moretti

Resumo

Introdução. A meningite criptocócica é uma infecção causada por leveduras do gênero Cryptococcus que acomete principalmente, pacientes com HIV, imunodeprimidos e transplantados de órgãos. Espécies gattii e neoformans são responsáveis por causarem meningite em humanos. Objetivos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o desempenho das técnicas moleculares de DNA microarray e Loop Mediated Isothermal amplification (LAMP) na identificação de Cryptococcus no líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite criptpcócica diferenciando as espécies gattii e neoformans. Metodologia. Estudo prospectivo desenvolvido no período de agosto de 2016 a outubro de 2018. Foram estudados amostras de líquido cefalorraquidiano positivas para Cryptococcus, positivos para bactérias e negativos para qualquer microrganismo, onde foram obtidas na enfermaria de moléstias infecciosas e do laboratório de microbiologia do Hospital de Clínicas da Unicamp. Trinta cepas de C. gattii foram cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz para testar nas metodologias estudadas. O DNA extraído diretamente do líquor e de seu isolado em cultura, foi submetido a PCR utilizando a região ITS e o gene CAP59 e posteriormente ao DNA microarray, LAMP e sequenciamento. Resultados. Foram extraídos 133 LCR, sendo 11 positivos para Cryptococcus, 15 positivas para bactérias, 107 negativos e trinta cepas de C.gattii. Foram identificados 8 amostras como C. neoformans e 2 como C. gattii e as cepas foram identificadas como C. gattii. Para a plataforma de ITS do microarray, de 11 amostras de LCR que foram extraídos o DNA, 10 amplificaram por PCR. Cinco amostras de LCR foram identificados, e as outras 5 não foram possíveis obterem resultados. Para os isolados testados nessa plataforma, houveram três amostras com reações inespecíficas e 7 foram identificadas corretamente. Para a plataforma de CAP59, houve amplificação por PCR em todas as amostras de LCR. Não houve identificação em três amostras e oito foram corretamente identificadas. Já para os isolados de LCR foi possível identificar corretamente todas as amostras. Foram realizados testes com diferentes iniciadores na metodologia de LAMP (SetA, SetD, Set1, Set2, Set3_neoformans e Set4_neoformans para identificar C. neoformans e SetB/C e Set1_gattii para identificar C. gattii). Dois conjuntos de iniciadores se mostraram específicos para C. neoformans e C. gattii respectivamente: Se3_neoformans e Set1_gattii. De 11 amostras de LCR testadas por LAMP, 9 foram testadas pelos iniciadores Set3_neoformans e duas pelo Set1_gattii. Pelo conjunto Set3_neoformans 55,5% foram identificadas como C. neoformans e em quatro amostras não houve amplificação e nas duas amostras de C. gattii testadas no conjunto Set1_gattii, não foi possível obter amplificação. Todos os isolados testadas pelo Set3_neoformans amplificaram na metodologia de LAMP. O conjunto Set1_gattii, foi testado apenas um isolado (P285) que foi identificado como C. gattii, pois a outra a amostra não cresceu em cultura. As amostras de LCR negativas e positivas para bactérias foram usadas como controle de nossos testes, e todas resultaram negativas. Conclusão. As metodologias provaram ser testes rápidos e confiáveis na identificação de Cryptococcus, porém é preciso que haja mais testes em relação a detecção direto de amostra clínica (AU)

• Processo FAPESP: 16/12414-2 - Avaliação do desempenho das técnicas moleculares de DNA Microarray e LAMP para diagnóstico e seguimento de pacientes com Meningite Criptocócica
• Beneficiário: Pamella Stivanelli
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado