Investigação funcional de ANKHD1 nas neoplasias malignas

Autor(es)

Patricia Cristina Rodrigues

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2010-02-26

Membros da banca

Sara Teresinha Olalla Saad; José Andrés Yunes; Licio Augusto Velloso; Serge Benichou; Gisele Wally Braga Colleoni

• Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad

Resumo

A proteína humana ANKHD1 (Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1) foi inicialmente descrita em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), e sua expressão também é observada em diversas linhagens leucêmicas. ANKHD1 é homóloga a proteína Mask (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain) de Drosophila melanogaster, relacionada com diferenciação, sobrevivência e proliferação de fotorreceptores dos olhos de drosófila. Interações diretas entre ANKHD1 e SHP2, proteína que exerce um papel crítico na hematopoiese, foram descritas nas linhagens mielóide K562, de adenocarcinoma de próstata, LNCaP, e em linhagem de mieloma múltiplo RPM1 8226. Porém pouco se sabe sobre a função de ANKDH1 e seu papel na leucemogênese. O objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento da ANKHD1 em processos biológicos relacionados com a leucemogênese. Para tal utilizamos duas abordagens metodológicas principais: inibição e hiperexpressão de ANKHD1. A inibição de ANKHD1 em linhagem LNCaP foi seguida de rastreamento das demais alterações gênicas associadas através de microarray. O microarray realizado mostrou 706 genes cuja expressão foi aumentada e 159 genes cuja expressão foi diminuída. Os genes foram agrupados em 26 classes funcionais, sendo que diversos genes conhecidos por regularem ciclo celular e apoptose tiveram seu perfil de expressão alterada. Importante ressaltar que a inibição de ANKHD1 resultou em aumento significativo da expressão de um grande número de Histonas, sugerindo seu papel no controle epigenético. Dentre as modulações validadas, algumas foram verificadas também em amostras provenientes de portadores de leucemia. Neste estudo, foi demonstrada a baixa expressão gênica de ANKHD1 em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células de medula óssea normal. Uma vez que esta amostra leucêmica se mostrou como um modelo natural de inibição de ANKHD1, a expressão de outros genes modulados no array foi testada, e o gene BMF, que se mostrou aumentado no array, se mostrou também mais expresso em amostras de leucemias, confirmando a oposição de expressão destes dois genes. Simultaneamente, células de leucemia aguda e mielodisplasia foram submetidas à ação de diversas drogas usadas no tratamento dessas doenças mostrando aumento de expressão de ANKHD1. Estes dados em conjunto com os observados no microarray sugerem a participação da ANKHD1 na via de JAK/STAT1 e vias de controle epigenético. A segunda abordagem utilizada neste trabalho foi a hiperexpressão ANKHD1, isoformas 1 e 2, em linhagens tumorais, seguidas da detecção de expressão protéica de ANKHD1 em cotransfecção com os genes Siva e Vpr. As proteínas Siva e Vpr foram recentemente descritas como capazes de interagir fisicamente com as isoformas 1 e 2 de ANKHD1 respectivamente. Tanto a proteína a Siva quanto a Vpr foram atribuídos papéis de indução de apoptose em linfócitos T. Observou-se que ao cotransfectarmos Siva ou Vpr com ANKHD1 houve diminuição de expressão de ANKHD1 tanto para a isoforma 1 quanto para isoforma 2 (western blotting) e também se observou que a isoforma 1 de ANKHD1 é citoplasmática assim como ocorre com a Mask de drosófila, porém a isoforma 2 se mostrou predominantemente nuclear em microscopia de fluorescência. A análise funcional da hiperexpressão de ANKHD1 seguida de análise por FACS sugere diminuição de apoptose em células leucêmicas. Em conclusão, o presente estudo identificou diversos possíveis participantes da via de sinalização de ANKHD1 por análise microarray, relatou a diminuição da sua expressão em amostras de pacientes portadores de leucemia, bem como o aumento de sua expressão em linhagens leucêmicas sob a ação de diversos tratamentos correntemente utilizados no combate de desordens hematopoiéticas. Descrevemos também o aumento de expressão da expressão do gene BMF nas mesmas amostras em que há diminuição de ANKHD1, corroborando os dados encontrados no microarray da inibição de ANKHD1. Descrevemos também pela primeira vez a localização nuclear da isoforma 2 de ANKHD1, confirmando todas as previsões computacionais de localização de ANKHD1. Os resultados aqui descritos sugerem que ANKHD1 esteja envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 na hematopoiese (AU)

• Processo FAPESP: 05/52977-1 - Investigação de vias de sinalização da MASK humana em células hematopoiéticas e nas síndromes mielodisplásicas
• Beneficiário: Patrícia Cristina Rodrigues
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado