Mecanismo de oxidação aeróbica de acetoacetato e 2-metilacetoacetato catalisada por mioglobina: implicações em desordens cetogênicas

Autor(es)

Douglas Ganini da Silva

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2011-04-20

Membros da banca

Etelvino Jose Henriques Bechara; Roger Frigerio Castilho; Ana Maria da Costa Ferreira; Leticia Labriola; Daniel Rettori

• Orientador: Etelvino Jose Henriques Bechara

Resumo

Acetoacetato (AA) e 2-metilacetoacetato (MAA) são compostos β-cetoácidos acumulados em diversas desordens metabólicas como no diabetes e na isoleucinemia, respectivamente. Examinamos o mecanismo de oxidação aeróbica de AA e MAA iniciada por intermediários reativos de mioglobina de coração de cavalo (Mb) gerados pela adição de H2O2. Uma rota quimioluminescente que envolve um intermediário dioxetânico cuja termólise gera espécies α-dicarbonílicas (metilglioxal e biacetilo) foi proposta e estudada. Emissão de luz ultra fraca acompanha a reação, e sua intensidade aumenta linearmente pelo aumento da concentração tanto de Mb (10-500 µM) quando AA (10-100 mM). Estudos de consumo de oxigênio mostraram que MAA é, como esperado, quase uma ordem de grandeza mais reativo que AA. Estudos de EPR com captação de spin, utilizando MNP, possibilitaram detectar adutos de MAA atribuíveis a um radical centrado no Cα (aN = 1.55 mT) e ao radical acetila (aN = 0.83 mT). O sinal do radical acetila é totalmente suprimido por sorbato, um conhecido e eficiente supressor de espécies tripletes, o que é consistente com uma rota reacional envolvendo um intermediário dioxetânico. Clivagem-α da ligação carbonila-carbonila do produto biacetilo triplete produziria, de fato, radicais acetila. Além disso, utilizando AA como substrato para Mb/H2O2, um sinal de EPR atribuível ao aduto MNP-AA• (aN = 1.46 mT e aH = 0.34 mT) foi observado e confirmado por efeito isotópico. O consumo de oxigênio e o rendimento de compostos α-dicarbonílicos foram dose-dependentes à concentração de AA ou MAA (1-50 mM) bem como à concentração de H2O2 adicionado às misturas de reação contendo Mb (até 1:10 quando medido o consumo de oxigênio, e até 1:25 quando medido o rendimento de compostos α-dicarbonílicos) e tert-butilhidroperóxido (até 1:200). Os perfis de pH (5,8-7,8) para consumo de oxigênio e rendimento de compostos α-dicarbonílicos mostraram maiores rendimentos para baixos valores de pH, indicativo de ferrilMb formada no ciclo peroxidático da proteína. Avaliando os níveis de lesão de Mb, os β-cetoácidos diminuíram o nível de desorganização protéica na estrutura secundária e terciária elicitada por H2O2. Ainda, houve maior preservação da estrutura primária da proteína, sendo que MAA protegeu mais em comparação a AA, embora quando utilizado este último composto, foi mostrado que há acetilação dose-dependente de Mb. Acetoacetato aumentou a velocidade de descoramento da hemeproteína, provavelmente por ataque de espécies tripletes geradas no sistema. Músculos de rato, plantar e sóleo, expostos ex vivo a concentrações citotóxicas de glicose oxidase (GOX, gera H2O2 em fluxo), foram protegidas pelos ésteres etílicos AAE e MAAE. Foi detectado biacetilo no meio intracelular em músculos expostos a MAAE e GOX. A concentração deste composto α-dicarbonílico é claramente relacionada à abundância de Mb em cada um dos tipos de músculos estudados. Em resumo, Mb tratada com metabólitos β-cetoácidos (AA e MAA) gera radicais centrados em carbono e produtos α-dicarbonílicos altamente reativos no estado triplete. Experimentos realizados com tecido muscular ex vivo sugerem que esta reação possivelmente ocorra in vivo. Levantamos a hipótese de que a geração de espécies carbonílicas reativas e seus adutos em condições de desbalanço metabólico possam contribuir para a compreensão das bases moleculares de desordens cetogênicas. (AU)

• Processo FAPESP: 07/56301-8 - Geração de intermediários reativos pela oxidação aeróbica de beta-cetoácidos catalisada por hemeproteínas
• Beneficiário: Douglas Ganini da Silva
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto