Mapeamento de potenciais interações envolvidas na agregação e na formação de fibrilas amilóides em apomioglobina

Autor(es)

Daniel Henrique do Amaral Corrêa

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2010-04-05

Membros da banca

Carlos Henrique Inacio Ramos; Sergio Marangoni; Jörg Kobarg; Debora Foguel; Vilma Regina Martins

• Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Resumo

Proteínas enoveladas incorretamente, com freqüência levam à formação de agregados fibrilares contendo extensas estruturas em folha-?, comumente denominadas de fibrilas amilóides. A hipótese acerca da capacidade de formar fibrilas amilóides com estruturas idênticas e ricas em estruturas beta, ser uma propriedade genérica de toda proteína, apoia-se no fato de até mesmo proteínas sem conexão com doenças, como a mioglobina, serem capazes de gerar estruturas fibrilares. Embora várias proteínas sejam intrinsecamente desordenadas, muitas são apropriadamente empacotadas, podendo se desenovelar totalmente ou parcialmente de maneira a expor regiões propensas à agregação, que podem converter o polipeptídeo em fibrilas amilóides. De fato, vários estudos sugerem que intermediários parcialmente enovelados estão envolvidos na fibrilogênese. A apomioglobina (apoMb) de baleia do espermacete é uma proteína bem caracterizada, que forma um intermediário durante o desenovelamento do estado nativo ou após a diluição do estado desenovelado em tampão de enovelamento. A mioglobina é uma proteína altamente solúvel, cujas propriedades do estado nativo não sugerem uma predisposição dessa em formar fibrilas amilóides, corroborado pela organização de sua seqüência de resíduos de aminoácidos em hélices-? bem definidas sem elementos de estrutura em folha-?. Contudo, até a mioglobina forma fibrilas amilóides em certas condições, sugerindo que a capacidade de formar fibrilas seja uma característica comum de toda proteína e, portanto, não estando relacionada a uma estrutura primária específica. Neste projeto, visamos mapear as potenciais interações envolvidas na agregação e formação de fibrilas amilóides em apomioglobinas. Para tanto, apresentamos aqui os estudos dos efeitos de 19 mutantes de apoMb na cinética amiloidogênica da mesma. A indução de fibrilas amilóides foi realizada através da incubação das apoMbs em tampão borato de sódio 50 mM, pH 9 e aquecidas a 65°C. O processo de agregação foi acompanhado por medidas da emissão de fluorescência de Tioflavina T (ThT) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Outras propriedades morfo-fisicoquímicas das amilóides de apoMb foram também estudadas: energia de ativação da formação de fibrilas, organização estrutural, citotoxicidade, efeito de semeadura, desmontagem por uréia. Nossos resultados mostram que alguns mutantes (7 no total) afetaram a cinética de formação das amilóides, e surpreendentemente, esses efeitos correlacionam-se bem com o efeito que a mutação tem sobre a estabilidade do estado nativo, mas não com o efeito sobre a estabilidade do estado intermediário do enovelamento. As estruturas globais (investigadas por difração de raios-X) das fibrilas formadas pelas ampomioglobinas selvagem e mutantes mostram-se indistinguíveis. Experimentos de citotoxicidade, utilizando um modelo de células neuronais N2A (neuroblastoma de camundongo), e semeadura, confirmam que as diferentes formas de agregados das proteínas são capazes de diminuir a viabilidade celular e de acelerar a formação das fibrilas. Generalizando, nossos resultados suportam a hipótese de que, embora o desenovelamento parcial preceda a formação de fibrilas em apomioglobina, a formação do intermediário de enovelamento não parece ser um passo obrigatório no processo e assim, o enovelamento e a formação de agregados/fibrilas são aparentemente distintos para essa proteína. (AU)

• Processo FAPESP: 05/51861-0 - Mapeamento de potenciais interacoes envolvidas na agregacao e na formacao de fibrilas amiloides em apomioglobina.
• Beneficiário: Daniel Henrique Do Amaral Corrêa
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado