Identificação de vias moduladas por microRNAs na diferenciação celular e manutenção da pluripotência em células humanas

Autor(es)

Ildercílio Mota de Souza Lima

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2017-09-28

Membros da banca

Rodrigo Alexandre Panepucci; Lygia da Veiga Pereira Carramaschi; Vitor Marcel Faça; Flavio Vieira Meirelles

• Orientador: Rodrigo Alexandre Panepucci

Resumo

Os microRNAs (miRs) desempenham um papel importante na biologia das células-tronco por meio da interação com seus mRNAs alvos, induzindo inibição da tradução e/ou degradação destes transcritos. Durante a diferenciação de células pluripotentes, os miRs podem ser induzidos ou reprimidos, no entanto, suas funções específicas são amplamente inexploradas. Nós investigamos os papéis funcionais de um conjunto selecionado de miRs na pluripotência e diferenciação celular, usando microscopia de fluorescência quantitativa (High Content Analysis). Para isso, foram empregadas a NTera-2 (células de carcinoma embrionário humano, CCE) e a H1 (células-tronco embrionárias humanas, CTEh) como modelos. Essas células foram transfectadas reversamente com trinta moléculas de miRs distintas (individualmente) ou moléculas controles. Após 3-4 dias de cultura, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com Hoechst / CellMask Blue (núcleo/citoplasma), anti-OCT4, anti-Ciclina B1 e imageadas com um sistema ImageXpress Micro HCA. O CellProfiler foi utilizado para quantificar vários parâmetros morfométricos e medidas de intensidade de OCT4 e Ciclina B1 em compartimentos nucleares e citoplasmáticos. Esses dados foram usados para gerar perfis fenotípicos multiparamétricos específicos de cada miR (usando KNIME) e o agrupamento desses dados levou à identificação de vias e processos envolvidos na indução de características de pluripotência ou diferenciação celular causadas por miRs com efeitos fenotípicos similares. Como exemplo, as vias de PI3K-AKT, WNT, TGF? e DICER foram encontradas como moduladas por alguns clusters fenotípicos e os transcritos de alguns alvos foram avaliados por qPCR para validar os achados. Parte do trabalho foi focada na regulação da via Notch por miRNAs em células pluripotentes, o que levou à observação de que o miR- 363-3p inibe a sinalização de Notch e promove pluripotência nessas células. A transfecção de miR-363-3p não apenas elevou as características de pluripotência em NTera-2 e H1, mas também protegeu as CCE da diferenciação induzida por cocultivo com OP9 expressando DLL1 e causou a diminuição no nível de transcritos de PSEN1. Em conclusão, o ensaio desenvolvido aqui provou ser uma ferramenta robusta na detecção de mecanismos moleculares, baseando-se na combinação de análises fenotípicas funcionais e bioinformáticas. (AU)

• Processo FAPESP: 13/27061-0 - O papel dos microRNAs na proliferação e diferenciação celular da linhagem pluripotente de carcinoma embrionário humano NTera-2
• Beneficiário: Ildercílio Mota de Souza Lima
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado