Otimização da técnica SAAT (Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation) para transformação de Phaseolus vulgaris

Autor(es)

Solange Rocha Monteiro de Andrade

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Piracicaba.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALA/BC)
• Data de defesa: 2001-04-10
• Orientador: Carlos Alberto Labate

Resumo

Phaseolus vulgaris L. era considerado recalcitrante à transformação por Agrobacterium. Entretanto, alterações no meio de co-cultivo, utilização de linhagens hipervirulentas de Agrobacterium e de vetores binários contendo genes vir demonstraram que o feijoeiro é susceptível à Agrobacterium. No entanto, ainda não foram obtidas plantas transgênicas de feijoeiro por meio deste método. Em 1997, Trick & Finer descreveram a metodologia SAAT ("Sonication assisted Agrobacterium mediated transformation"). Esta técnica consiste em produzir microferimentos no explante através da sonicação por curtos períodos de tempo na presença do Agrobacterium. Por meio deste método foram obtidas plantas transgênicas de soja e trigo. O objetivo do presente trabalho foi ajustar a metodologia SAAT para a transformação de P. vulgaris. A variedade de feijoeiro utilizada foi a Olathe Pinto, a linhagem de Agrobacterium tumefaciens foi LBA4404:pTOK. Foram estudados o efeito do pré-tratamento, tempo de co-cultivo, duração do SAAT e presença de acetoceringona. Os resultados demonstram que a expressão transitória e estável da β-glucoronidase foi maior quando os eixos embrionários foram pré-tratados por 10 a 14 dias em meio de multibrotação. O antibiótico geneticina (G418) apresentou maior capacidade de seleção de brotos do que canamicina, nas concentrações estudadas. SAAT de 60 segundos dos explantes apresenta melhor expressão transitória e estável da β-glucoronidase. O tempo de co-cultivo líquido de 2 horas seguido de 48 horas em meio sólido, na ausência de acetoceringona, apresentou a maior expressão transitória. A presença de acetoceringona (20 mg/l) aumentou a expressão transitória. Pré-incubação por 24 horas não aumentou a eficiência do tratamento SAAT. As análises de microscopia óptica e de varredura demonstraram a presença de rupturas na epiderme, quebras da parede celular e invasão do Agrobacterium nos tecidos subepidérmicos. Os resultados demonstraram que o método SAAT é uma técnica viável para a transformação de P. vulgaris via Agrobacterium. (AU)

• Processo FAPESP: 97/00684-2 - Superexpressão do gene Lhcb1 (Chlorophyll a/b binding protein) em plantas de feijão para aumentar a capacidade fotossintética em condições limitantes de luz
• Beneficiário: Solange Rocha Monteiro de Andrade
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado