Otimização de parâmetros de transferência in vivo do gene do hormônio de crescimento visando a correção fenotípica de camundongos anões

Autor(es)

Eliana Rosa Lima Filha

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/BT)
• Data de defesa: 2016-06-24

Membros da banca

Cibele Nunes Peroni; Paolo Bartolini; Edson Aparecido Liberti

• Orientador: Cibele Nunes Peroni

Resumo

A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 &mu;g DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 &mu;L de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 &mu;L. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo. (AU)

• Processo FAPESP: 14/07380-6 - Otimização de parâmetros de transferência in vivo do gene do hormônio de crescimento visando a correção fenotípica de camundongos anões
• Beneficiário: Eliana Rosa Lima Filha
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado