Manipulação genética de fatores de transcrição diferencialmente expressos sob indução de expressão de enzimas heterólogas em Aspergillus nidulans

Autor(es)

Everton Paschoal Antoniel

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2020-08-07

Membros da banca

André Ricardo de Lima Damásio; Rafael Silva Rocha; Fernando Segato

• Orientador: André Ricardo de Lima Damásio

Resumo

Como forma de reduzir a dependência em combustíveis fósseis, os biocombustíveis e produtos químicos obtidos através da hidrólise enzimática da biomassa vegetal vem sendo foco de inúmeras investigações científicas. Todavia, a recalcitrância natural da parede celular vegetal, e o alto preço das enzimas ativas em carboidratos, fazem com que a sua degradação completa e eficiente ainda seja um desafio a ser superado para sua viabilização econômica. Dessa forma, o objetivo central deste trabalho foi avaliar a influência da manipulação genética de fatores de transcrição (FTs) sobre os níveis de produção/secreção de enzimas degradadoras da biomassa vegetal. Sabe-se que existe uma relação direta entre superexpressão de genes e estresse de retículo endoplasmático em fungos filamentosos. Em respostas a isso, a célula desencadeia um intenso programa, chamado unfolded protein response, para manter a proteostase celular. Desta forma os FTs manipulados neste trabalho foram selecionados a partir de dados de RNAseq, enriquecimento de GO terms e redes de co-expressão gênica do fungo modelo Aspergillus nidulans exposto ao estresse celular induzido pela superexpressão e secreção de proteínas heterólogas. Estas análises resultaram na seleção de 5 FTs - AN8772, AN9373, AN7331, AN7913, e AN7592 - presentes em módulos de co-expressão enriquecidos com GO terms tais como: proteasomal ubiquitin-independent protein catabolic process (GO:0010499), sporulation (GO:0043934), calcium ion homeostasis (GO:0055074), Golgi vesicle transport (GO:0048193), translation (GO:0006412), protein refolding (GO:0042026) e small molecule catabolic process (GO:0044282). Os 5 FTs foram deletados com sucesso em A. nidulans através da técnica de CRISPR-Cas9. O fenótipo das cepas mutantes foi avaliado quanto a integridade de parede celular (Congo Red ¿ CR e Calcofluor White ¿ CFW), estresse osmótico (Sorbitol), estresse iônico (CaCl2), estresse oxidativo (Menadiona), esporulação e secreção de proteases. A cepa delta AN7913 e delta AN7592 foram as mais resistentes a estressores da integridade de parede celular. A cepa ?AN7592 foi a única a apresentar esporulação reduzida e resistência a estresse osmótico. Para avaliação da resposta de estresse oxidativo a cepa delta AN8772 foi mais sensível, enquanto o delta AN7913 foi mais resistente. Nas análises de proteases as cepas delta AN9373, delta AN7331 e delta AN7913 tiveram um aumento na secreção de proteases, demostrando que estes FTs podem ter potencial função na regulação da via de secreção. Além disto, o processo da construção das cepas super-expressando uma enzima heteróloga está em andamento e poderá responder se estes FTs têm influência na secreção de enzimas heterólogas em A. nidulans. Concluímos que foi possível selecionar FTs potencialmente envolvidos na via de secreção de proteínas em A. nidulans utilizando dados de transcriptoma e redes de co-expressão. Além disso, demonstramos que o FTs deletados estão envolvidos em diferentes processos biológicos, destacando o dado preliminar em que demonstramos maior secreção de proteases em alguns mutantes. Por fim, pretendemos aprofundar nossos estudos realizando experimentos adicionais para avaliar os níveis de secreção destes mutantes através da superexpressão de uma enzima recombinante alvo e, eventualmente, descrever o mecanismo que induz este possível aumento de secreção (AU)

• Processo FAPESP: 17/26315-9 - Influência de fatores de transcrição na secreção de enzimas em Aspergillus nidulans
• Beneficiário: Everton Paschoal Antoniel
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado