Mecanismos epigenéticos em hepatoblastomas: análise do transcriptoma e sua regulação por metilação de DNA

Autor(es)

Maria Prates Rivas

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Biociências (IBIOC/SB)
• Data de defesa: 2021-07-30

Membros da banca

Ana Cristina Victorino Krepischi; Cecilia Maria Lima da Costa; Oswaldo Keith Okamoto; Eduardo Moraes Rego Reis

• Orientador: Ana Cristina Victorino Krepischi

Resumo

Mecanismos epigenéticos em hepatoblastomas: análise do transcriptoma e sua regulação por metilação de DNA. Tumores hepáticos em crianças são raros, representando 1 - 4% de todos os tumores sólidos pediátricos, sendo o hepatoblastoma o mais frequente. Hepatoblastomas são tumores embrionários, com idade muito precoce de manifestação e apresentação histológica característica, que recapitula diferentes fases da organogênese do fígado. Em decorrência de sua raridade, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e progressão deste tipo tumoral ainda são pouco explorados e praticamente inexistem biomarcadores para estratificação de risco. Apresentando a menor taxa de mutação somática dentre os tumores sólidos, o hepatoblastoma é um câncer que ainda tem sua origem e mecanismos moleculares debatidos na literatura científica. Há reconhecido link entre epigenética, desenvolvimento fetal e tumores pediátricos e, nos últimos anos, o estudo com foco na epigenética de hepatoblastomas ganhou maior importância como um mecanismo chave. Este estudo teve como objetivo central a avaliação do papel da metilação de DNA na alteração do padrão de expressão gênica de hepatoblastomas. Foram avaliadas no total um conjunto de 30 amostras de hepatoblastomas e 11 amostras de tecido hepático não tumoral, derivadas de colaboração com três centros de câncer infantil da cidade de São Paulo (AC Camargo Cancer Center, GRAAC e ITACI). Também foram utilizadas linhagens celulares de tumores hepáticos e células pluripotentes induzidas (IPSCs) diferenciadas em hepatoblastos e hepatócitos-like. Utilizando técnicas como qRT-PCR, western blot, imunohistoquímica, metabolômica, RNASeq e nível global de hidroximetilação, os objetivos foram (a) identificar o mecanismo de hipometilação de DNA em hepatoblastomas e determinar o nível de 5-hidroximetilcitosina; (b) caracterizar as amostras de hepatoblastoma de acordo com as etapas de diferenciação celular de hepatócitos; (c) avaliar o impacto de alterações de metilação previamente identificadas no transcriptoma tumoral (genes codificadores e não codificadores). Estudamos o padrão de expressão de genes da maquinaria de metilação de DNA (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L, UHRF1, TET1, TET2 e TET3) nestes tumores e o nível global de 5hmC. Detectamos elevada expressão dos genes da maquinaria epigenética, principalmente UHRF1, TET1 e TET2, em associação com enriquecimento do conteúdo de 5hmC. Estes resultados indicam a ocorrência em hepatoblastomas de desmetilação ativa do DNA, mediada por TETs, provavelmente durante os estágios iniciais do desenvolvimento do fígado. Além disso, níveis mais baixos de 5hmC em hepatoblastomas podem estar associados à redução da sobrevida global. Em seguida, avaliamos a utilização do padrão de expressão de genes da maquinaria epigenética e de diferenciação hepática como elementos-chave para a estratificação de hepatoblastomas. Foi possível a estratificação das amostras tumorais em três grupos, destacando a importância de 13 genes (TET1, TET2, TET3, DNMT1, DNMT3A, UHRF1, ALB, CYP3A4, TDO2, UGT1A1, AFP, HNF4A e FOXA2) para o estabelecimento desta classificação. Os resultados permitiram correlacionar os grupos identificados com distintos níveis de metilação global de DNA, que estão de acordo com a fase de diferenciação hepática em que as células tumorais se encontrariam, o que corrobora a hipótese de bloqueio de diferenciação do órgão de origem. Deste modo, propusemos assinaturas tumorais associadas a diferentes fases de diferenciação hepática com base em expressão gênica e em nível de metilação de DNA. Evidenciamos redução significativa de expressão gênica e proteica de NNMT em hepatoblastomas. Níveis mais elevados de NNMT foram estatisticamente associados ao diagnóstico tardio em hepatoblastoma, uma reconhecida variável clínica de pior prognóstico. A análise metabolômica não direcionada detectou metabolismo lipídico aberrante em hepatoblastomas, sugerindo que a diminuição de NNMT pode estar associada à redução detectada do conteúdo lipídico em amostras de hepatoblastoma, possivelmente relacionada a concentrações alteradas de metabólicos ligados a função do NNMT ou precursores de NAD+. Os dados apresentados aqui mostraram pela primeira vez que a redução de NNMT ocorre em hepatoblastomas, fornecendo apoio adicional à teoria de que sua regulação negativa é um fenômeno geral em câncer de fígado. Com o objetivo de compreender melhor os processos biológicos alterados, realizamos análises de bioinformática a partir de dados de RNASeq de hepatoblastomas e amostras de fígado normais. Foi identificado um grupo de 1492 genes com expressão diferencial entre tumores e amostras controle (Differentially Expressed Genes - DEGs), 1.031 deles regulados positivamente e 461 com diminuição de expressão. A lista de DEGs contém genes codificadores de proteínas e ncRNAs, estes principalmente regulados positivamente. Oitenta e cinco dos genes com expressão diferencial são expressos exclusivamente em amostras tumorais, sendo aproximadamente 55% deles ncRNAs. Dentre os 50 principais genes, aqui definidos como aqueles com a maior alteração de expressão, 42% correspondem a ncRNAs; três (MAGED4, SNO144-16 e RP11-431J24.2) com expressão detectável exclusivamente em tumores. Adicionalmente, 16 destes genes com maior diferença de expressão entre tumores e fígado normal já haviam sido identificados anteriormente como alterados neste grupo tumoral (GCK, HMGA2, INS-IGF2, DKK1, CPA6, TTC36, LIX1, PART1, DKK4, CDCA7, GNG4, THRSP, CNDP1, CYP2B7P, ASPG e HAO2). Os processos biológicos foram enriquecidos em regulação negativa do metabolismo, principalmente de amina, nicotinamida e lipídios / ácidos graxos; também há alteração de mecanismos epigenéticos, como metilação do DNA, ncRNAs e silenciamento de genes por miRNA; citotoxicidade e vias de sinalização, incluindo mediada por citocinas. Uma rede de interação miRNA-mRNA foi construída, identificando quatro genes (miR-186, miR-214, miR-377 e miR-494), cada um deles conectado a mais de 10 mRNAs. Os principais processos biológicos relacionados a esta rede miRNA-mRNA foram associados também a metabolismo e reações de oxidação de lipídios e carboidratos. Em conclusão, a análise de RNASeq evidenciou grande alteração de vias metabólicas em hepatoblastomas, incluindo lipídios, aminas e nicotinamidas, o que retoma resultados anteriores de nosso grupo. Também revelou grande modificação na rede de expressão de ncRNAs neste tipo de tumores. A detecção de processos biológicos alterados fornece pistas para o entendimento das vias de tumorigênese em hepatoblastomas e os achados de genes centrais indicam candidatos a futuras análises funcionais. (AU)

• Processo FAPESP: 16/23462-8 - Estudo de mecanismos epigenéticos em tumores de fígado: modulação da expressão de genes reguladores da epigenética e análise de expressão gênica por RNAseq em hepatoblastoma.
• Beneficiário: Maria Prates Rivas
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado