Avaliação bioquímica, estrutural e funcional de uma fosfodiesterase da peçonha de Crotalus durissus collilineatus

Autor(es)

Isadora Sousa de Oliveira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2021-06-18

Membros da banca

Eliane Candiani Arantes Braga; Wuelton Marcelo Monteiro; Jonas Augusto Rizzato Paschoal; Denise Vilarinho Tambourgi

• Orientador: Eliane Candiani Arantes Braga; Manuela Berto Pucca

Resumo

Peçonhas ofídicas apresentam alta complexidade de componentes e, para a elucidação de seus mecanismos de toxicidade, é necessário que os mesmos sejam isolados e caracterizados, para que sua ação durante o envenenamento se torne esclarecida, facilitando o tratamento do respectivo sintoma. Muitos componentes minoritários da peçonha de Crotalus durissus collilineatus ainda não foram estudados. A fosfodiesterase (PDE) já havia sido identificada na peçonha, mas não tinha sido isolada ou caracterizada. Enzimas da classe PDE são responsáveis pela quebra das ligações fosfodiéster de ácidos nucléicos, ATP, ADP, NAD, NGD, AMPc e GMPc, interferindo em processos fisiológicos ou patológicos, o que as tornam alvos terapêuticos de diversas patologias. Assim, os objetivos deste estudo foram o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional da PDE da peçonha de C. d. collilineatus (CdcPDE). O isolamento da CdcPDE foi realizado por combinação de técnicas de cromatografia líquida, como filtração molecular, trocas aniônica e catiônica, respectivamente, sendo seu rendimento <1%. Por SDS-PAGE, foi possível observar sua migração como um monômero e a presença de glicosilações na molécula. Por espectrometria de massas, a CdcPDE apresentou duas massas moleculares determinadas por MALDI-TOF, 100 e 105 kDa, e por LCMS/MS em união com o sequenciamento amino-terminal, foi possível determinar uma sequência para a CdcPDE, formada por 829 resíduos de aminoácidos. Por análises in silico, foi possível estimar as suas estruturas secundária e terciária, bem como a sua interação com o substrato bis(p-nitrofenil) fosfato. Utilizando este mesmo substrato, a CdcPDE apresentou maior atividade enzimática entre os pH 8 e 8,5, a 37 ºC, e a melhor temperatura para armazená-la foi 0 °C. Alguns agentes redutores e um quelante metálico inibiram a atividade enzimática de CdcPDE, sugerindo que as pontes dissulfeto em sua estrutura são essenciais para a atividade, bem como os íons metálicos, o que a caracteriza como uma metaloenzima. Os parâmetros cinéticos obtidos foram: Km = 0,38 mM, Vmáx = 0,7 &mu;M/s, kcat = 0,14 s-1 e sua eficiência catalítica foi igual a 0,37 mM.s-1, mostrando alta afinidade pelo substrato utilizado, bem como, eficiência cinética, quando comparada a outras PDE oriundas de peçonhas ofídicas. Outros ensaios demonstraram que a CdcPDE reduz/perde atividade enzimática com a perda de água e em contato com TFA, e sua temperatura de desenovelamento foi de 65,71 ºC. Por ELISA, foi possível observar que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan reconhece a CdcPDE e, por análise in silico, foram identificados 16 possíveis epítopos imunogênicos na molécula. Por fim, foi possível observar que a CdcPDE inibe a agregação de plaquetas induzidas por ADP e é uma molécula citotóxica para queratinócitos humanos, apresentando valor de IC50 de 71,65 &mu;g/mL. Esta ação nunca foi relatada para PDE de peçonhas ofídicas, sugerindo também, a possibilidade de efeitos locais destas moléculas durante o envenenamento. Assim, estas enzimas podem ser importantes ferramentas moleculares para a pesquisa, bem como, para a terapêutica, visto que apresentam funções bioquímicas capazes de interferir tanto com processos fisiológicos quanto patológicos. (AU)

• Processo FAPESP: 17/03580-9 - Avaliação bioquímica, estrutural e funcional de uma fosfodiesterase da peçonha de Crotalus durissus collilineatus
• Beneficiário: Isadora Sousa de Oliveira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado