Desenvolvimento de plataformas sustentáveis para estabilização e purificação da Proteína Verde Fluorescente recombinante produzida por Escherichia coli

Autor(es)

Nathalia Vieira dos Santos

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Araraquara. 2020-12-19.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Araraquara
• Data de defesa: 2020-11-26
• Orientador: Jorge Fernando Brandão Pereira; Fernando Lucas Primo

Resumo

A biotecnologia permitiu o desenvolvimento de novas biomoléculas para aplicações médicas e industriais. No entanto, o uso de muitos produtos biológicos notáveis ainda é limitado em grande escala devido às suas baixas estabilidades (que dificultam distribuição, armazenamento e manuseio) e preços muito elevados (principalmente devidos aos processos complexos e caros de produção e purificação). Um melhor entendimento das propriedades e estabilidade das biomoléculas, aliados ao desenvolvimento de plataformas mais simples, baratas e sustentáveis para estabilização e purificação de produtos biotecnológicos, pode ajudar a superar essas limitações e expandir seus usos comerciais. Assim, o objetivo do trabalho foi melhorar as aplicações em larga escala de biomoléculas usando a Proteína Verde Fluorescente Melhorada (EGFP, do inglês Enhanced Green Fluorescent Protein, importante biomarcador e biossensor) como uma prova de conceito. Nesse sentido, a pesquisadora projetou estudos aprofundados da estrutura de EGFP e suas propriedades de fluorescência, avaliou sua estabilidade na presença de diferentes solventes ou sob condições de estresse, e desenvolveu novos sistemas sustentáveis para a estabilização e purificação da EGFP usando Líquidos Iônicos (LIs), sais orgânicos e polímeros compatíveis com biomoléculas. Nos estudos de propriedades da EGFP, foi possível detectar um pico de fluorescência adicional e nunca relatado para esta proteína, resolvendo uma controvérsia científica sobre as conformações e atividade da EGFP. Além disso, nos estudos de estabilidade em pH, foi possível demonstrar a relação entre a fluorescência da EGFP e pH, assim como elucidar os impactos do pH ácido na estrutura da proteína. Essas informações podem ajudar no desenvolvimento de novos biossensores de pH neutro-a-ácido. Os estudos da atividade da EGFP na presença de LIs e sob condições de estresse mostraram que LIs podem ter diferentes impactos na estabilidade de proteínas, dependendo de sua natureza, concentração e comprimento da cadeia alquílica. Por exemplo, alguns LIs como cloreto de colina, octanoato de colina e decanoato de colina protegeram a fluorescência de EGFP, enquanto LIs baseados em imidazólios com maior comprimento de cadeia alquílica reduziram sua atividade. Além disso, foi possível encontrar LIs que triplicaram a preservação a longo prazo da atividade da EGFP em temperatura ambiente, que podem potencialmente ser aplicados como estabilizadores de proteínas em formulações biofarmacêuticas. Na etapa de purificação, uma plataforma sustentável foi desenvolvida associando sistemas bifásicos aquosos (compostos por polímeros e sais) e ultrafiltração, obtendo EGFP > 97 % pura e também recuperando mais de 60% dos solventes utilizados no processo. Em conclusão, os estudos da atividade e estabilidade da EGFP, aliados ao desenvolvimento de técnicas alternativas sustentáveis de purificação de baixo custo, podem ampliar seu uso comercial e tem aplicação potencial para outras biomoléculas. (AU)