Estudo genético da resistência aos antibióticos beta-lactâmicos, quinolonas e aminoglicosídeos em bactérias isoladas de pacientes com suspeita de meningite no Estado de São Paulo

Autor(es)

Anelise Stella Ballaben

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2019-08-13

Membros da banca

Ana Lucia da Costa Darini; Ilana Lopes Baratella da Cunha Camargo; Juliana Pfrimer Falcão; Cristiano Gallina Moreira

• Orientador: Ana Lucia da Costa Darini; Leonardo Neves de Andrade

Resumo

No Brasil, existem poucos relatos de membros da Ordem Enterobacterales isoladas de líquido céfalo raquidiano causando meningite. Nos últimos 20 anos, bacilos gram-negativos (BGN) produtores de beta-lactamases se tornaram um dos principais desafios para o tratamento das infecções, principalmente pela pandemia das enzimas CTX-M e KPC. Este trabalho teve como objetivo investigar a genética e epidemiologia molecular da resistência aos antibióticos de importância clínica no tratamento de infecções causadas por membros da Ordem Enterobacterales e bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NF) isolados de pacientes com suspeita de meningite no Estado de São Paulo. Foram estudados 66 isolados de membros da Ordem Enterobacterales e BGN-NF resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo espectro cujas investigações microbiológicas foram previamente realizadas nos Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto e São Paulo. Essas bactérias foram isoladas de sangue e LCR de pacientes com suspeita de meningite, no período de 2007 a 2014. Os genes codificadores de beta-lactamases, determinantes de resistência às quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) e 16S RNA metiltransferase ribossômica (16S-RMTase) assim como a tipagem dos plasmídeos foram pesquisados por PCR e confirmados por sequenciamento. Além disso, a tipagem molecular dos isolados foi realizada por sequenciamento de multilocus (MLST). A determinação cromossômica ou plasmideal dos genes de resistência de interesse foi avaliada por I-Ceu-I-PFGE ou S1-PFGE, respectivamente. Experimentos de clonagem, transformação, conjugação e inibição de bombas de efluxo assim como pesquisa molecular de determinantes de virulência e sequenciamento do genoma completo também foram realizados. Entre os 66 isolados, 39 foram identificados como BGN-NF sendo 21 Acinetobacter baumannii, 11 Pseudomonas aeruginosa, 1 Pseudomonas putida, 3 Stenotrophomonas maltophilia e 3 Ochrobactrum antrophi, além de 27 membros da Ordem Enterobacterales, sendo 17 Klebsiella pneumoniae, 5 Klebsiella aerogenes, 2 Klebsiella oxytoca, 2 Enterobacter cloacae e 1 Serratia marcescens. Entre os 21 isolados de A. baumannii, 17 possuíam upstream ao gene blaOXA-23-like o elemento de inserção ISAba1. Plasmídeos AB-GR2, ii AB-GR4, AB-GR6 e AB-GR8 foram detectados em 9 isolados e 4 isolados apresentaram IncFrepB. No entanto, em todos isolados foi confirmada localização cromossômica de blaOXA-23-like. Por MLST foram detectados 9 ST diferentes, em dois singletons e três complexos clonais (CC). Entre os 11 isolados de Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa 1206/13 (ST1602) e P. aeruginosa 463/12 (ST235) apresentaram blaCTX-M-2 e no isolado 1206/13 blaGES-1 também foi detectado. Após análise dos dados obtidos por sequenciamento completo do genoma foi possível avaliar que blaGES-1 está organizado como gene cassete associado ao novo integron de classe I, In1600 no qual blaCTX-M-2-ISCR1 também estava associada, resultando em uma estrutura de ~11.680pb. Experimentos de S1-PFGE determinaram que ambos os genes bla estavam inseridos em plasmídeo IncP2 de ~340kb. Em P. aeruginosa 463/12, blaCTX-M-2 foi encontrado downstream à ISCR1 inserido no cromossomo do isolado. O gene blaIMP-16 foi detectado no isolado de P. putida. Os genes blaTEM, blaCTX-M-2, blaCTX-M-8, blaCTX-M-15 e blaKPC foram os mais detectados entre os isolados de Klebsiella sp. Entre os PMQR, apenas qnrB-1 foi encontrado. Ainda, estes isolados apresentaram grande diversidade de replicons, sendo colE e IncL/M os mais detectados. Foram encontrados diversos determinantes de virulência entre os isolados de K. pneumoniae, destes entB, iroD, fecIRA, ugE, wabG, fimH e ureA foram detectados em todos os isolados. Entre os 5 isolados de K. aerogenes, blaCTX-M-15, qnrB-1 e aac(6\')-Ib foram encontrados em apenas 1 isolado. Além disso, outro isolado de E. cloacae apresentou hiperexpressão de AmpC. Diferentes plasmídeos Inc foram detectados entre os isolados de K. aerogenes e E. cloacae. Isolados que apresentaram fenótipo de alto nível de resistência aos aminoglicosídeos (HLAR) tiveram seus genomas sequenciados e os mecanismos de resistência foram investigados mais detalhadamente. Em alguns isolados, a combinação da produção de diferentes enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs) ocasionou no fenótipo HLAR apresentado, enquanto em outros, produção de 16S-RMTase foi detectada. Além disso, presença de hiperexpressão de bombas de efluxo também foi encontrada entre os isolados. (AU)

• Processo FAPESP: 15/23484-9 - Estudo molecular de bactérias gram-negativas produtoras de beta-lactamases isoladas de pacientes com suspeita de meningite na região de Ribeirão Preto
• Beneficiário: Anelise Stella Ballaben
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto