Avaliação de mutações pontuais no gene ABL por metodo de cromatografia liquida desnaturante de alta performance (D-HPLC) em pacientes com leucemia mieloide cronica tratados com inibidores de tirosina quinase

Autor(es)

Cintia do Couto Mascarenhas

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2009-07-17

Membros da banca

Carmino Antonio de Souza; Israel Bendit; Afonso Celso Vigorito

• Orientador: Katia Borgia Barbosa Pagnano; Carmino Antonio de Souza

Resumo

O desenvolvimento da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) tem como característica a formação do cromossomo Philadelphia que envolve a quebra do gene BCR gerando um rearranjo molecular denominado BCR-ABL, cujo produto final é uma proteína de fusão citoplasmática que determina a patogenia da doença. Esta proteína é uma tirosina quinase (TK) que possui capacidade de auto-ativação e para a inativação desta proteína, foram desenvolvidos os inibidores da tirosina quinase (ITK), que tem a capacidade de se ligar no mesmo sítio de ligação da molécula de ATP. Esta ligação impede a transferência dos grupos fosfatos aos substratos subseqüentes, bloqueando a cascata de transdução de sinais e prevenindo a ativação das vias mitogênica dependente da quinase Bcr-Abl e anti-apoptóticas levando à morte do fenótipo BCR-ABL.Um dos principais mecanismos de resistência ao tratamento com ITK são as mutações pontuais, sendo a T315I foco de estudos mais detalhados por tornar a proteína mutante altamente insensível a todas as drogas inibidoras da proteína TK disponíveis atualmente Foi utilizado neste trabalho a técnica de D-HPLC para fazer screening de mutações nos pacientes com LMC com resposta sub ótima ou falha de tratamento de acordo com os critérios da Leukemia Net. Para o screening do éxon 6 foram selecionados 93 pacientes com LMC: 5 eram intolerantes, 67 resistentes e 21 com resposta subótima. Como controle negativo foi usado o sangue periférico doadores de sangue do Hemocentro da UNICAMP. Para o screening de mutações de todo o gene BCR-ABL foram estudados 37 pacientes com LMC e como controle negativo, usamos a linhagem celular HL60 que não possui a translocação BCR-ABL. No screening do éxon 6, 23 amostras (25%) mostraram um perfil de eluição no D-HPLC anormal em relação ao controle, o que sugeriu a presença de mutação. A sobrevida global (OS) para todo grupo foi de 80% em uma mediana de tempo de observação de 30 meses. OS para pacientes sem mutações foi de 87% e para os pacientes com mutações foi de 56% em uma mediana de tempo de observação 37 e 10 meses, respectivamente (p <0,0001, RR = 68). No screening de todo o gene BCR-ABL 17 (46%) tiveram perfil cromatográfico diferente do controle Como estávamos estabelecendo a padronização do método, procedemos com o seqüenciamento de todas as amostras e os resultados obtidos foram comparados com a seqüência depositada no banco de dados GenBank (U07563). Das 17 amostras com alteração do perfil cromatográfico, observamos a presença de mutação em 13 amostras. Acreditamos que isso se deva a sensibilidade do método de D-HPLC que é capaz de identificar tanto polimorfismos quanto mutações com maior eficiência que o seqüenciamento. Em resumo, o D-HPLC demonstrou ser um método sensível e prático para o acompanhamento do aparecimento de mutações no domínio da quinase na rotina clínica. Mutações nessa região estudada são clinicamente relevantes e podem conferir um pior prognóstico. A detecção precoce pode ser uma ferramenta importante para otimizar a terapêutica na LMC. (AU)

• Processo FAPESP: 06/54026-7 - Análise da expressão gênica diferencial e avaliação laboratorial da mutação T315l por métodos moleculares e cromatográficos em pacientes com leucemia mielóide crônica tratados com inibidores de tirosina quinase
• Beneficiário: Cintia Do Couto Mascarenhas
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado