Regulação do promotor SMyHC3 pelos receptores nucleares GR e COUP-TFII: um trabalho solo ou conjunto?

Autor(es)

Izabella Luisa Tambones

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2020-08-05

Membros da banca

Ana Carolina Migliorini Figueira; Celso Eduardo Benedetti; Fernando Alves de Melo

• Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira

Resumo

O receptor nuclear Chicken ovalbumin upstream promoter transcription fator II (COUP-TFII) é apontado como um importante elemento envolvido no desenvolvimento cardíaco. Sua participação nesse contexto consiste na regulação de genes específicos, como o gene da isoforma 3 da cadeia pesada de miosina (SMyHC3). O SMyHC3 é caracterizado como um gene átrio-específico em codornas, e seu promotor tem se mostrado essencial para a diferenciação das câmaras cardíacas em diferentes espécies. Estudos in vivo e in silico revelaram que sua atividade átrio-específica é controlada via um elemento complexo de resposta a receptores nucleares (ECRRN) situado em sua região promotora. Esse ECRRN possui três sítios putativos de ligação dos NRs, denominados genericamente como A, B e C. Análises celulares revelaram que COUP-TFII é o principal candidato a regulação do promotor do gene SMyHC3, e sugerem que sua atividade regulatória é desempenhada em cooperação com os receptores de andrógenos (AR) e de glicocorticoides (GR). O objetivo deste trabalho visou avaliar a interação do AR, GR e COUP-TFII entre si e com o ECRRN buscando compreender o papel desses receptores frente a regulação do promotor do SMyHC3 no desenvolvimento cardíaco. Em razão da baixa quantidade proteíca obtida para o AR durante a execução deste projeto, esse receptor não foi incluído nas análises aqui apresentadas. Dessa forma, os ensaios de anisotropia de fluorescência mostraram uma maior afinidade do COUP-TFII pelo ECRRN, comparado ao GR. Também foram realizadas medidas de afinidade entre os NRs e os diferentes sítios putativos de ligação no ECRRN (A, B e C) e suas combinações (AB, BC e AC). Ambos receptores demonstraram preferência pelo mesmo sítio único (B) e de um sítio duplo cada (AB para COUP-TFII e BC para GR). Ensaios do tipo pull-down e de termoforese em microescala indicam que os receptores GR e COUP-TFII interagem fisicamente (Kd = 3,4 ± 0,7 µM), e podem formar um heterodímero atípico. Análises computacionais por docking e dinâmica molecular mostraram uma dupla interface possível entre a hinge e DBD (1) e os LBDs (2) de GR e COUP-TFII. Ensaios de transativação celular revelaram um crosstalk repressivo entre GR e COUP-TFII para a ativação dos elementos responsivos DR1 e do ECRRN. Ensaios de anisotropia de fluorescência utilizando ambos receptores sugerem que a transrepressão vista para o COUP-TFII ligado ao DR1 ocorre pelo acoplamento do GR. Finalmente, foi possível confirmar a ação conjunta de GR e COUP-TFII na regulação do ECRRN, evidenciando um crosstalk que pode ocorrer de maneira direta via acoplamento ou pela formação de um heterodímero GR/COUP-TFII ou indireta via modificação da cromatina (AU)

• Processo FAPESP: 18/02481-0 - Regulação do promotor SMyHC III pelos receptores nucleares AR, GR e Coup-TFII: um trabalho solo ou conjunto?
• Beneficiário: Izabella Luisa Tambones
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado