Design of polymers and recombinant elastin-like polypeptides thin films based on high-throughput screening methods

Autor(es)

Rogério Aparecido Bataglioli

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia Química
• Data de defesa: 2021-04-08

Membros da banca

Marisa Masumi Beppu; Everson Alves Miranda; Jorge Vicente Lopes da Silva; Osvaldo Novais de Oliveira Júnior

• Orientador: Marisa Masumi Beppu; Bradley D Olsen

Resumo

A funcionalização de superfícies com recobrimentos nanoestruturados tem sido explorada para superar desafios biotecnológicos, da entrega direcionada de fármacos à captura seletiva de analitos para diagnóstico. Proteínas recombinantes tem um papel de destaque no desenvolvimento de superfícies bioativas, permitindo o desenvolvimento de macromoléculas com as funcionalidades desejadas. A técnica layer-by-layer (LbL) tem se popularizado como uma estratégia simples e versátil para a funcionalização de superfícies com mínimas restrições quanto à superfície e aos materiais depositados. Ambas as estratégias, no entanto, requerem esforços significativos para determinar as condições adequadas produzir novos materiais. Esta tese teve como objetivo facilitar a produção de materiais à base de biopolímeros e proteínas recombinantes, a partir de métodos automatizados de alta produtividade (high-throughput). Inicialmente, a técnica LbL foi adaptada para a deposição de filmes multicamadas em placas de 96 de poços, permitindo a investigação de diferentes condições de deposição dos recobrimentos na mesma batelada. Este método mostrou-se efetivo para a produção de recobrimentos de polissacarídeos, indicando que a quantidade de grupos amino e carboxílicos livres dos recobrimentos varia de acordo com o pH de deposição. Filmes híbridos à base de polipeptídios do tipo elastina (ELPs) e polissacarídeos, formados a partir de interações eletrostáticas, demostraram que condições de pH que promoveram baixos graus de ionização dos polieletrólitos e a presença de aminoácidos com resíduos hidrofóbicos nas ELPs favoreceram o crescimento dos recobrimentos. Esta tese também explorou a versatilidade no design de ELPs para investigar uma biblioteca de interações complementares para a formação de recobrimentos multicamadas. Interações do tipo Spy-Tag/Spy-Catcher e ZE/ZR (ou zíperes de leucina), dentre outras, mostraram-se capazes de direcionar a deposição auto-organizada dos recobrimentos. Recobrimentos formados por interações Spy-Tag/Spy-Catcher também apresentaram significativa estabilidade em diversas condições de pH (3.0 - 12.0) e força iônica (5.0 mol/L NaCl) que dissociaram filmes formados por interações eletrostáticas. O método high-throughput-LbL também foi usado para investigar o efeito das condições de deposição na incorporação e liberação de uma molécula modelo (calceína) em recobrimentos de poli(ácido acrílico)/poli(alilamina). Neste caso, maiores valores de pH (> 8.5) e a presença de sais como NaCl ou MgCl2 (ambos a 0.05 mol/L) nas soluções polieletrolíticas favoreceram a incorporação de calceína nos recobrimentos. O método de incorporação também alterou a morfologia dos recobrimentos e os mecanismos de liberação de calceína, resultando em taxas de liberação mais lentas para incorporação durante a deposição das multicamadas. Por fim, esta tese também explorou estratégias high-throughput para testar a síntese de proteínas recombinantes. Protocolos de biologia molecular, da transformação à biossíntese das proteínas, foram automatizados, permitindo testar dezenas de combinações de linhagem celular-vetor em cada experimento. Foram desenvolvidos ainda protocolos automatizados para a quantificação de proteína total (Bradford) e específica (6×His-tag immunoassay), auxiliando na triagem das condições adequadas para a biossíntese de mCherry (proteína modelo). De modo geral, esta tese destacou o uso de métodos high-throughput para facilitar o desenvolvimento de materiais à base de biopolímeros e proteínas que demandem inúmeras etapas de testagem e otimização, contribuindo para acelerar os ciclos de inovação na área de biotecnologia (AU)

• Processo FAPESP: 16/10193-9 - Desenvolvimento de mecanismos de ativação e controle da liberação de fármacos em mochilas celulares para uso em terapias antitumorais
• Beneficiário: Rogério Aparecido Bataglioli
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto