Investigação funcional de ANKHD1 e proteínas relacionadas em neoplasias hematológicas

Autor(es)

João Agostinho Machado Neto

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2015-02-20

Membros da banca

Fabíola Traina; Eduardo Magalhães Rego; Rodrigo Alexandre Panepucci; José Vassallo; José Andrés Yunes

• Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad; Fabíola Traina

Resumo

A identificação de genes/proteínas diferencialmente expressos em neoplasias hematológicas e a investigação funcional destas proteínas no fenótipo neoplásico são essenciais para o entendimento da biologia da doença. ANKHD1 é altamente expressa em células de leucemia aguda e tem potencial para regular vários processos celulares através de seus domínios de repetição de anquirina. Nosso grupo de pesquisa havia previamente identificado a interação entre ANKHD1 e SIVA através de ensaio de duplo híbrido. Outras proteínas potencialmente relacionadas à ANKHD1 que foram de interesse deste trabalho foram a Stathmin 1 que interage com SIVA e a YAP1 que interage com ANKHD1 em células não hematológicas. O objetivo principal do presente trabalho foi investigar a participação funcional de ANKHD1 e proteínas relacionadas em neoplasias hematológicas. Utilizamos modelos de linhagens leucêmicas humanas e células hematopoéticas primárias provenientes de indivíduos normais (n=52) e de pacientes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica (SMD; n=65), neoplasia mieloproliferativa (NMP; n=82), leucemia mieloide aguda (LMA; n=60) e leucemia linfoide aguda (LLA; n=19). Técnicas para avaliação de expressão gênica (qPCR), expressão e interação proteica (western blotting), ensaios funcionais de migração (ensaio transwell), proliferação (MTT e clonogenicidade in vitro, formação de tumor in vivo) e apoptose (Anexina V/IP, TUNEL), e inibição de proteínas de interesse através do uso de inibidores farmacológicos ou ferramentas de terapia gênica foram utilizados. A interação entre ANKHD1 e SIVA foi confirmada por ensaios de coimunoprecipitação. Em linhagens celulares leucêmicas U937 e Jurkat, o silenciamento de ANKHD1 reduziu a proliferação celular, migração e o crescimento tumoral, enquanto que a inibição de SIVA aumentou a migração e o crescimento tumoral e reduziu a sensibilidade à apoptose induzida por radiação UV de células U937. A inibição de ANKHD1 reduziu a atividade de Stathmin 1 e a interação entre SIVA/Stathmin 1. Grande parte das linhagens leucêmicas e amostras primárias de pacientes com neoplasias hematológicas não apresentou a expressão de YAP1, e o silenciamento de ANKHD1 não modulou a atividade de YAP1 em células U937. A expressão de Stathmin 1 foi significativamente elevada em amostras de células hematopoéticas de pacientes com neoplasisa hematológicas (SMD AREB-1/AREB-2, LMA, LLA e mielofibrose primária) quando comparada às amostras de doadores saudáveis. O silenciamento de Stathmin 1 reduziu a proliferação celular e clonogenicidade em células leucêmicas U937, Namalwa e células HEL JAK2V617F. Especificamente em células HEL JAK2V617F, a inibição de Stathmin 1 ou o tratamento com o agente estabilizador de microtúbulos paclitaxel teve um efeito potencializador ao tratamento com ruxolitinib, inibidor de JAK1/2, na indução de apoptose. Em conclusão, propomos que a ANKHD1 participa do fenótipo neoplásico de células leucêmicas através de sua interação com SIVA, inibição de SIVA e ativação de Stathmin 1. Os nossos resultados indicam que a função de ANKHD1 na leucemogênese independe de sua interação com YAP1. Em células humanas com ativação constitutiva da via JAK2/STAT, identificamos a relevância funcional da participação de Stathmin 1 no fenótipo neoplásico (AU)

• Processo FAPESP: 11/06840-5 - Estudo da função de ANKHD1 na proliferação, apoptose e ciclo celular em neoplasias hematológicas
• Beneficiário: João Agostinho Machado Neto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado