Análise do potencial terapêutico da proteína R-Espondina 1 humana recombinante (rhRSPO1): Produção, purificação, caracterização e aplicações na regeneração de intest

Autor(es)

Gabriel Levin

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI)
• Data de defesa: 2020-08-13

Membros da banca

Mari Cleide Sogayar; Elisabeth de Fatima Pires Augusto; Elisabeth Cheng; Vitor Antonio Fortuna; Patricia Gama; Paulo Lee Ho

• Orientador: Mari Cleide Sogayar

Resumo

As R-Espondinas (RSPOs) compõem uma família de proteínas secretadas conhecidas por seus papéis importantes na proliferação, diferenciação e morte celular, induzindo a via de Wnt. Estudos têm demonstrado a importância das RSPOs na regulação de vários processos tecido-específicos, em particular a proliferação de células-tronco intestinais. RSPO1 destaca-se quanto ao seu potencial uso terapêutico na área de Medicina Regenerativa, dado seu potencial mitogênico em células-tronco, em particular, na manutenção do nicho de células-tronco da cripta do intestino delgado. Neste trabalho, foram geradas plataformas estáveis de expressão da RSPO1 humana recombinante (rhRSPO1) empregando os dois sistemas de expressão de células de mamífero mais utilizados para a produção de biofármacos, células HEK293 e CHO-DG44. Descrevemos em detalhes a produção estável em altos níveis da rhRSPO1, com alto grau de pureza e devidamente caracterizada em relação à sua estrutura peptídica e padrão de glicosilação, além de sua atividade biológica in vitro e in vivo. Visando sua aplicação na regeneração de intestino, investigamos a atividade da proteína rhRSPO1 sobre o cultivo de unidades organóides intestinais (UO) e na formação de intestino delgado engenheirado (TESI, do inglês Tissue-Engineered Small Intestine murino utilizando scaffolds biodegradáveis, bem como ensaios preliminares sobre a regeneração de fígado. Concluimos que o tratamento com rhRSPO1, e a consequente ativação da via canônica de Wnt, melhorou o cultivo de UO intestinais in vitro, aumentando seu tamanho e taxa de sobrevivência. Pelos ensaios de Engenharia de Tecidos in vivo, constatamos que o tratamento resultou em na melhora da formação do TESI, com aumento do grau de desenvolvimento dos tecidos, aumento de massa e da taxa de sucesso na pega do enxerto. Avaliamos ainda a atividade funcional da rhRSPO1 na adaptação intestinal em modelo de zebrafish induzido à Síndrome do Intestino Curto (SIC) pela ressecção cirúrgica da porção medial do intestino. Neste experimento de resgate, no qual a rhRSPO1 foi administrada por via intraperitoneal nos animais por uma ou duas semanas, observamos que o tratamento aumentou a proliferação precoce de células-tronco intestinais (ISCs), o acúmulo de β-catenina e reduziu a perda de peso dos peixes após ressecção maciça do intestino, mas não interferiu nos parâmetros intestinais de adaptação e na formação de esteatose hepática neste modelo. Assim, constatamos que a rhRSPO1 é essencial para a manutenção do nicho de ISC e a homeostase do epitélio intestinal, melhorando a regeneração epitelial após lesão. Portanto, podemos concluir que a plataforma de expressão desenvolvida nesse projeto foi bem-sucedida quanto à geração de rhRSPO1 com qualidade e em quantidade suficiente para ser utilizada em estudos funcionais, em escala laboratorial, na área de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa aplicada ao tratamento da SIC em modelos animais. Concluímos ainda que o tratamento com rhRSPO1 é bastante promissor no que diz respeito à geração de um intestino engenheirado funcional e melhora dos sintomas da SIC. Entretanto, novas otimizações do processo produtivo, bem como um maior número de estudos biológicos fazem-se necessários para que tratamentos com rhRSPO1 venham a ser viáveis e seguros, futuramente, para estas e outras aplicações terapêuticas. (AU)

• Processo FAPESP: 15/11128-3 - Análise do potencial terapêutico da proteína recombinante humana RSPO1 na regeneração de intestino delgado em modelo animal utilizando tecnologias de Engenharia tecidual
• Beneficiário: Gabriel Levin
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto