Caracterização do papel do homologo da quinase ATR na resposta ao estresse replicativo em L. major

Autor(es)

Gabriel Lamak Almeida da Silva

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2022-09-14

Membros da banca

Luiz Ricardo Orsini Tosi; Leticia Fröhlich Archangelo; Júlia Pinheiro Chagas da Cunha; José Renato Rosa Cussiol

• Orientador: Luiz Ricardo Orsini Tosi

Resumo

As células eucarióticas desenvolveram mecanismos para manter e replicar seu genoma cuja integridade e transmissão são constantemente desafiadas por danos ao DNA e impedimentos da replicação. A proteína quinase Ataxia-Telangiectasia and Rad3-related (ATR), um membro da família phosphatidylinositol 3-kinase-like, garante a manutenção e a estabilidade do genoma, e é um dos principais reguladores da reposta a danos no DNA de eucariotos. Nesta tese de doutorado, eu investiguei a conservação e a relevância funcional do homologo da ATR no metabolismo do DNA de Leishmania major, um parasito protozoário com um singular genoma plástico. Usando o sistema de CRISPR/cas9 para edição do genoma nós conseguimos gerar uma linhagem com a quinase ATR fusionada a uma tag de Myc (MycATR); uma linhagem heterozigota para a deleção da região C-terminal da quinase com uma tagging de myc no N-terminal da proteína RPA1 (ATRΔC+/-mycRPA); e uma linhagem que expressa uma tag de Myc e homozigótica para a deleção da região C-terminal da ATR (mycATRΔC). Nossos resultados mostram que a localização da quinase ATR é dependente da região C-terminal e não é só limitada ao núcleo, mas também localizada no kinetoplasto e outra localização extranuclear. As células ATRΔC+/-mycRPA acumulam DNA de fita simples no kinetoplasto e no núcleo na presença ou não de hidroxiureia. Entretanto, o S-G2/M checkpoint parece ser perdido nas células mycATRΔC, levando a um acúmulo de células aberrantes e um aumento do conteúdo de DNA. A perda total da região C-terminal da ATR não afetou o programa de iniciação da replicação. De fato, ambas linhagens, mycATR and mycATRΔC, usam sítios alternativos de replicação para manter a replicação nas regiões internas do cromossomo. A região C-terminal da ATR também é importante para garantir a replicação das regiões sub-teloméricas sob estresse replicativo. Por fim, a perda total da região C-terminal da ATR quinase leva a um aumento do marcador de dano no DNA yH2A e de células aberrantes após estresse replicativo. Portanto, os resultados sugerem que a ATR de L. major é importante para o controle do ciclo celular, bem como para a manutenção do genoma sob estresse replicativo, prevenindo o acúmulo de fita simples de DNA no núcleo e no kinetoplasto, com também protegendo a replicação das regiões sub-teloméricas. (AU)

• Processo FAPESP: 16/16454-9 - Caracterização da quinase ATR de Leishmania major e de seu papel na sinalização do estresse no processo de replicação do DNA
• Beneficiário: Gabriel Lamak Almeida da Silva
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto