Participação de DNA polimerase iota na ausência de Pol eta na síntese translesão de células humanas irradiadas com luz UV e caracterização de células de pacientes mutados em PCNA

Autor(es)

Davi Jardim Martins

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI)
• Data de defesa: 2022-11-04

Membros da banca

Carlos Frederico Martins Menck; Fernando Kok; Enrique Mario Boccardo Pierulivo; André Passaglia Schuch

• Orientador: Carlos Frederico Martins Menck

Resumo

A luz ultravioleta (UV), quando incide sobre as células humanas, é capaz de lesionar o DNA, gerando fotoprodutos conhecidos como dímeros de pirimidina, podendo resultar tanto em instabilidade gênica quanto em morte celular. Estas lesões, quando detectadas pela célula recrutam proteínas responsáveis pelo reparo por excisão de nucleotídeos (do inglês, NER). Caso não sejam reparadas até o momento da replicação, estas lesões bloqueiam a polimerase replicativa, sinalizando para um mecanismo de tolerância conhecido como síntese translesão (do inglês, TLS). Nesse processo, polimerases específicas, chamadas polimerases de TLS, são recrutadas para o local e realizam o bypass da lesão, permitindo à célula continuar a replicação. Dentre as polimerases de TLS descritas, a Pol&#951 (Pol eta) é a mais estudada, devido ao fato de a sua ausência levar a uma síndrome conhecida como xeroderma pigmentosum variante (XP-V), em que os pacientes apresentam hipersensibilidade à luz UV e aumento da incidência de tumores em regiões expostas ao sol. Apesar de diversos estudos, ainda não se sabe como a TLS dos dímeros ocorre nestes pacientes, deixando em aberto uma questão que implica, diretamente, na alta frequência de tumores de pele em pessoas XP-V. Sabe-se que a Pol&#953 (Pol iota), outra polimerase, está presente em foci de replicação, juntamente com a Pol&#951, porém sua função na TLS ainda não está definida. Nesse contexto, o objetivo principal do presente projeto é investigar o papel de Pol&#953 no bypass de lesões UV em células humanas. Para isso, utilizou-se linhagens celulares deficientes em NER (XP-C) silenciadas para Pol&#953 e/ou Pol&#951, previamente estabelecidas em nosso laboratório. Estas linhagens foram expostas a diferentes doses de luz UVC para a análise de viabilidade celular, morte celular (sub-G1 e ativação de caspase-3), progressão no ciclo, capacidade de migração e duplicação, quantificação da sinalização do dano, bloqueio da forquilha de replicação pelos dímeros de pirimidina e quantificação de quebras no DNA. Os resultados presentes nesta tese mostraram que a perda apenas de Pol&#953 não afeta a linhagem na maioria das metodologias. Entretanto, após a retirada de Pol&#953 de células que já não possuíam Pol&#951, observou-se uma redução acentuada da resistência da linhagem à luz UV, com morte elevada (24, 48 e 72 h após o tratamento) e bloqueio em fase G1/S do ciclo celular, porém sem aumento na sinalização do dano. Além disso, esta linhagem apresentou problemas na duplicação e migração celular após a irradiação com UVC e parada acentuada de forquilhas de replicação. Por fim, a quantificação de quebras 24 h após a irradiação evidenciou que a hipersensibilidade desta linhagem não é devido ao aumento da fragmentação do DNA, e sim uma incapacidade da célula em lidar com o dano quando ambas as polimerases de TLS estão ausentes. Baseado nestes resultados, concluiu-se que Pol&#953 atua de fato como backup na ausência de Pol&#951 na TLS de fotoprodutos. Também estudamos células mutadas em PCNA. Dados preliminares mostraram que esta mutação torna a linhagem mais sensível a lesões do tipo quebra-dupla e termosensibilidade, sendo interessante para o estudo da replicação e reparo de DNA. (AU)

• Processo FAPESP: 17/05680-0 - Mecanismos de síntese translesão em células humanas
• Beneficiário: Davi Jardim Martins
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto