Importância do inflamassoma no desenvolvimento das formas graves de COVID-19 em pacientes e em modelo experimental murino

Autor(es)

Tamara Silva Rodrigues

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2022-12-19

Membros da banca

Dario Simões Zamboni; Patricia Torres Bozza Viola

• Orientador: Dario Simões Zamboni

Resumo

Introdução: Casos graves de COVID-19 são caracterizados por um forte processo inflamatório que pode levar à falência de órgãos e morte do paciente. O inflamassoma de NLRP3 é uma plataforma molecular que promove a inflamação através da clivagem e da ativação das principais moléculas inflamatórias, incluindo caspase-1 ativa (Casp1p20), IL-1β e IL-18. A ativação do inflamassoma de NLRP3 pode ocorrer pela via canônica ou não canônica, quando há participação de caspase-4/CASP4 humana (caspase-11/CASP11 de camundongo). Objetivo: O objetivo deste trabalho foi investigar a ativação do inflamassoma e sua participação na fisiopatologia da COVID-19. Métodos e Resultados: Inicialmente, infectamos monócitos humanos primários in vitro com SARS-CoV-2 e avaliamos a ativação do inflamassoma. Observamos que a infecção por SARS-CoV-2 desencadeia a ativação da caspase-1, avaliada através do ensaio de luminescência, Caspase-Glo 1, e produção de IL-1β, quantificada por ELISA. Também observamos que o SARS-CoV-2 desencadeia a liberação de LDH em monócitos e requer a presença de SARS-CoV-2 viável. Em seguida, medimos a formação de \"puncta\" de NLRP3 e ASC e identificamos que o SARS-CoV-2 desencadeia a formação de \"puncta\" em um processo que também necessita de vírus viável. Posteriormente, infecções in vivo realizadas em camundongos transgênicos humanizados, K18-hACE2, deficientes ou não para CASP11, indicaram que camundongos hACE2 Casp11-/- foram protegidos quanto ao desenvolvimento da doença, com perda de peso corporal reduzida, variação de temperatura reduzida, área parenquimatosa pulmonar reduzida, escore clínico reduzido da doença e redução da mortalidade. Através do ensaio FAM-YVAD que permite a marcação de caspase-1 intracelular ativa, evidenciamos uma porcentagem maior de PBMCs FAM-YVAD+ em pacientes no dia zero de internação em comparação com os controles saudáveis. Além disso, a observação microscópica dessas células permitiu a visualização de \"puncta\" de NLRP3 e ASC em PBMCs, indicando que existem inflamassomas ativos em células de pacientes com COVID-19. Similarmente, encontramos o inflamassoma de NLRP3 ativo em tecidos de autópsia de pacientes post mortem através de ensaios de imuno-histoquímica e imunofluorescência. Vale salientar que os produtos derivados do inflamassoma, como Casp1p20 e IL-18 presentes nos soros dos pacientes, correlacionaram-se com os marcadores de gravidade de COVID-19, incluindo IL-6 e LDH. Os níveis mais elevados de IL-18 e Casp1p20 foram associados à gravidade da doença e pior evolução clínica. Avaliando amostras de casos letais de COVID-19, também evidenciamos a expressão gênica aumentada de CASP4 por RTPCR na nasofaringe e nos pulmões dos pacientes e esse resultado se correlacionou com a expressão de componentes do inflamassoma e mediadores inflamatórios, incluindo caspase-1 e IL-1β. Através do ensaio de western blotting, também observamos a ativação de CASP4 em PBMCs de pacientes com COVID-19 moderada e grave. Conclusão: Observamos que o SARS-CoV-2 induz a regulação positiva e a ativação da CASP4/CASP11 e esse processo contribui para a ativação do inflamassoma em resposta ao SARS-CoV-2. Nossos resultados sugerem que o inflamassomas participam da fisiopatologia da doença, indicando que essas plataformas podem ser um marcador de gravidade da doença e um potencial alvo terapêutico para COVID-19. (AU)

• Processo FAPESP: 19/21978-5 - Papel da via de sinalização por STING no reconhecimento e controle da infecção por Leishmania spp
• Beneficiário: Tamara Silva Rodrigues
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado