Enterococcus faecalis: Cluster epa

Autor(es)

Lívia Oliveira Dantas Clementino

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Carlos.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT)
• Data de defesa: 2023-05-19

Membros da banca

Alessandro Silva Nascimento; Kate Cristina Blanco; Beatriz Gomes Guimarães; Marco Antonio Seiki Kadowaki; Mario de Oliveira Neto

• Orientador: Alessandro Silva Nascimento

Resumo

A resistência bacteriana a antibióticos é um problema de saúde pública, com tendência a se agravar ao longo do tempo. A consequência disto é refletida na quantidade de mortes provocadas por infecções de tais microrganismos, estimada em 7.7 milhões em 2019, número com tendência a aumentar. Neste contexto, iniciou-se o estudo de quatro enzimas presentes no cluster gênico epa. As proteínas Epa sintetizam e exportam carboidratos constituintes da parede celular de Enterococcus, envolvidos também na composição de biofilmes. Realizaram-se clonagem, expressão heteróloga e purificação com as enzimas EpaI, EpaOX, EpaB e EpaE de Enterococcus faecalis DSM20478. Apesar de diferentes estratégias aplicadas para otimizar a expressão e purificação dessas proteínas, a EpaE foi a única a apresentar rendimento e estabilidade razoáveis para ser submetida a uma triagem envolvendo múltiplas condições de cristalização. Um conjunto de dados foi coletado na linha Manacá do anel síncrotron brasileiro, o Sirius. O grupo espacial do cristal é o P21, apresentando fração de twinning pseudomeroedral. A estrutura refinada da EpaE foi determinada a 2.85 Å. Ela tem conformação tetramérica na unidade assimétrica, com um enovelamento do tipo Rossman. Análises realizadas pelo servidor PDBePISA indicaram que as interfaces formadas pelas cadeias A e B, e C e D são mais estáveis do que a B e C, e A e D, sugerindo se tratar de um dímero de dímeros. O sítio catalítico da EpaE foi identificado a partir da sobreposição estrutural com outra RmlA de maior resolução. Durante o refinamento da EpaE, foi percebida a presença de uma densidade eletrônica correspondente a molécula de timidina, presente no provável sítio alostérico da EpaE. O protocolo estabelecido para medir a atividade de RmlAs foi aplicado, ele detecta fosfato em solução a partir do reagente verde de malaquita. Entretanto, foi observado que o reagente verde de malaquita não é uma boa solução colorimétrica por não possuir intensidade das curvas de absorbância proporcional à concentração de fosfato no meio. Para sanar este problema, a técnica de detecção de fosfato com azul de molibdênio foi testada na medida da atividade específica da EpaE. Por fim, o programa AlphaFold2 realizou predição das demais enzimas presentes no cluster epa, possibilitando elucidação de algumas funções dessas enzimas na síntese e transporte do antígeno polissacarídeo enterocócico de E. faecalis. Neste trabalho, determinamos a primeira estrutura cristalográfica de uma enzima do cluster epa e avançamos na identificação de um potencial inibidor da enzima EpaE. (AU)

• Processo FAPESP: 17/24901-8 - Estudos estruturais para a prospecção de agentes contra doenças infecciosas humanas
• Beneficiário: Lívia Oliveira Dantas Clementino
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto