Caracterização estrutural e busca por inibidores das proteases dos vírus emergentes: Vírus da Febre Amarela e SARS-CoV-2

Autor(es)

Gabriela Dias Noske

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Carlos.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT)
• Data de defesa: 2023-10-24

Membros da banca

Glaucius Oliva; Richard Charles Garratt; Beatriz Gomes Guimarães; Germán Gustavo Sgro; Daniela Barretto Barbosa Trivella

• Orientador: Glaucius Oliva; Andre Schützer de Godoy

Resumo

Os recentes avanços em pesquisa possibilitaram uma maior compreensão do mecanismo de diversas doenças virais e auxiliaram no desenvolvimento de vacinas e medicamentos. No entanto, as doenças virais ainda representam uma das maiores preocupações de saúde pública e econômicas mundiais, o que evidencia a necessidade constante do desenvolvimento de novos antivirais. Dentre os vírus ainda sem fármacos específicos para seu tratamento, estão os pertencentes ao gênero flavivírus, que inclui os vírus causadores da dengue, zika e febre amarela (YFV). O vírus da febre amarela (YFV) tem genoma composto por uma única fita de RNA que codifica uma única poli proteína contendo três proteínas estruturais e sete não estruturais. A NS3 tem dois domínios: um domínio protease e um domínio helicase/NTP-ase. A NS3 protease age juntamente com uma outra proteína não estrutural como cofator, a NS2B, que auxilia o enovelamento correto da NS3pro e permite que tenha uma forma ativa. O complexo NS2B-NS3pro auxilia na clivagem da poli proteína imatura, liberando as proteínas formadoras do complexo de replicação viral. Considerando a importância deste complexo no ciclo de replicação viral, é evidente que ele representa um importante alvo no planejamento de candidatos antivirais. Sendo assim, o objetivo deste projeto consistiu em determinar a estrutura cristalográfica da enzima NS2B-NS3pro e utilizá-la na busca por inibidores. A sequência codificante da proteína do vírus foi clonada, expressa e purificada. Também foi possível obter cristais da enzima, utilizados para a resolução da estrutura da enzima, resultando num modelo final a 2.9 Å de resolução. Além disso, avaliamos a atividade da proteína utilizando um ensaio baseado em um produto fluorescente. Foi possível determinar as constantes cinéticas da mesma, além de realizar a triagem de inibidores. Dos aproximadamente 1000 compostos testados, 18 hits foram encontrados, 6 deles apresentando IC50 com valores inferiores à 1.0 μM. Os ligantes mais promissores tiveram atividade antiviral testada em células contendo o replicon de YFV, no qual 3 compostos apresentaram EC50 em baixo micromolar. Em conclusão, nós conseguimos avançar com a clonagem, expressão e purificação do complexo NS2B-NS3 protease do YFV. Além disso, obtivemos cristais da proteína, que possibilitaram a resolução de sua estrutura cristalográfica. A enzima demonstrou elevada atividade proteolítica contra o peptídeo sintético fluorescente, que foi de suma importância para a triagem de inibidores. Adicionalmente, diante da pandemia causada pelo novo coronavírus, o SARS-CoV-2, e como parte do projeto colaborativo conduzido pelo CIBFar/CEPID como esforço emergencial para o desenvolvimento de antivirais contra o SARS-CoV-2, estudos também foram desenvolvidos com as proteases deste vírus. Uma das proteases do vírus, a Mpro, é uma proteína dimérica amplamente estudada e explorada para o desenvolvimento de antivirais. No entanto, os detalhes sobre seu processo de auto maturação permaneciam desconhecidos. Neste trabalho, a enzima Mpro foi expressa e purificada, em três construções diferentes (IMT-Mpro, Mpro e C145S Mpro). Ambas as construções foram cristalizadas e tiveram estruturas cristalográficas resolvidas, assim como foram caracterizadas em solução. Além disso, a enzima C145S Mpro teve estrutura determinada a 3.5Å, em complexo com o peptídeo nativo do Nterminal, utilizando crio-microscopia eletrônica. Analisamos ainda a influência de diferentes inibidores no processo de maturação da enzima. Por fim, pudemos inferir que a clivagem do N-terminal não é crítica para a dimerização da enzima, mas sim, as mudanças conformacionais que são ocasionadas pelo ajuste induzido após ligação covalente do substrato. A elucidação das mudanças funcionais e estruturais que ocorrem durante esse processo de maturação obtidas neste trabalho fornecem informações importantes para a compreensão deste mecanismo e para a proposição de inibidores específicos, que tenham como alvo etapas intermediárias do processo de maturação da enzima. Além disso, este trabalho nos ajuda a ter um maior entendimento sobre as proteases dos vírus da febre amarela e SARS-CoV-2, e habilita novas estratégias para o desenvolvimento de novos antivirais. (AU)

• Processo FAPESP: 18/25600-4 - Descoberta e desenvolvimento de candidatos antivirais contra o vírus da Febre Amarela baseados na estrutura do complexo NS2B-NS3 protease
• Beneficiário: Gabriela Dias Noske
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto