Estrutura, função e dinâmica das enzimas da via de síntese de novo da vitamina B6 em Staphylococcus aureus

Autor(es)

Angélica Luana Carrillo Barra

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Carlos.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT)
• Data de defesa: 2023-10-03

Membros da banca

Alessandro Silva Nascimento; Ana Paula Ulian de Araujo; Marco Antonio Seiki Kadowaki; Mario de Oliveira Neto; Daniela Barretto Barbosa Trivella

• Orientador: Alessandro Silva Nascimento

Resumo

A via de síntese de novo da vitamina B6 (piridoxal 5-fosfato) é conservada na maioria dos organismos exceto em mamíferos. A síntese de piridoxal 5-fosfato (PLP) é realizada por um complexo de duas enzimas: Pdx1 e Pdx2. A enzima Pdx2 possui atividade glutaminase e transfere uma molécula de amônia para Pdx1, que utiliza amônia, ribose 5-fosfato (R5P) e gliceraldeído 3-fosfato (G3P) para sintetizar o PLP. Não há dados dessa via em Staphylococcus aureus, um patógeno oportunista de extrema preocupação. Deste modo, propomos investigar bioquimicamente e estruturalmente o complexo SaPLP (SaPdx1-SaPdx2) sintase e fornecer um melhor entendimento dessa via como um possível alvo para o desenvolvimento de antibióticos. Para isso, as enzimas foram expressas em Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) RIL e purificadas por cromatografia de afinidade a níquel, seguida de clivagem por TEV e cromatografia de exclusão molecular (SEC). O estado oligomérico de SaPdx1 em solução foi analisado por SEC-SAXS em três condições diferentes. Os resultados revelaram que a oligomerização de Pdx1 é dependente da concentração de sal e há um equilíbrio entre dodecâmeros e hexâmetros em condições específicas. Para compreender o significado biológico desse fenômeno, foram realizadas medidas de SEC-MALS antes e após a atividade. Esses experimentos esclareceram que Pdx1 precisa se associar a um dodecâmero para sintetizar PLP. Na estrutura cristalográfica de SaPdx1 uma molécula de etilenoglicol foi encontrada ligada ao sítio ativo, mimetizando as interações do substrato R5P. Na unidade assimétrica (ASU), foram encontrados dois monômeros, mas análises das interfaces entre macromoléculas indicaram que o dodecâmero é a conformação mais provável. Com relação ao complexo SaPLP, uma mutação foi feita na proteína SaPdx2, pois foi descrito na literatura que essa mutação está relacionada com a oligomerização do complexo PLP sintase. A estabilidade do complexo SaPLP nativo e mutante foi verificada por SEC-MALS e pelas estruturas cristalográficas. Observou-se que a interação do complexo nativo é transitória e só é saturado durante a catálise. Como esperado, o complexo mutante exibiu maior estabilidade. Ensaios cinéticos revelaram que o complexo SaPLP é mais eficiente do que a enzima SaPdx1 na presença de fontes alternativas de amônia, evidenciando a importância da enzima SaPdx2 para a catálise. Além disso, pela primeira vez, foi observado um efeito inibitório em altas concentrações de G3P, afetando mais a SaPdx1 do que o complexo. A estrutura cristalográfica de SaPdx1-2mut corrobora a hipótese de que o complexo é totalmente ocupado pelas glutaminases por meio da inativação da Pdx2. Em suma, nossos dados oferecem novas perspectivas para entender essa via complexa e fornecem informações valiosas para o desenvolvimento de novos antibióticos. (AU)

• Processo FAPESP: 18/21213-6 - Caracterização estrutural das enzimas da via de síntese de vitaminas B1 e B6 em Plasmodium falciparum e Mycobacterium tuberculosis
• Beneficiário: Angélica Luana Carrillo Barra
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto