Implicações de mutações e conformações na modulação de atividade enzimática em uma β-glicosídeo hidrolase e na tirosina quinase Abl1-KD

Autor(es)

Felipe Akihiro Melo Otsuka

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2023-02-08

Membros da banca

Sandro Roberto Marana; Luis Eduardo Soares Netto

• Orientador: Sandro Roberto Marana

Resumo

Enzimas são catalisadores de reações químicas, cuja atividade é sensível a sua sequência de aminoácidos, estado oligomérico e as condições do meio em que se encontram, e.g., temperatura e força iônica. Fundamentalmente, populações estatisticamente discretas com conformações distintas influenciam e conferem estados de maior e menor atividade à enzima. Nesta tese, são discutidos em dois tipos de enzimas as interrelações entre mutações, conformações e atividade catalítica. No capítulo I, é examinada uma β-glicosídeo hidrolase de Spodoptera frugiperda (Sfβgly) expressa e purificada em sistema heterólogo (E. coli), a qual sua atividade é sensível ao seu estado oligomérico. Além disso, mutações acumulativas em sua sequência são capazes de alterar sua estereosseletividade frente a substratos sintéticos. Os resultados indicam que a Sfβgly em solução forma um equilíbrio de estado entre dímero e monômero com uma constante de dissociação (KD) de 3,7±0,3 µM, sendo a forma dimérica cerca de 2,5 vezes mais ativa comparada com seu estado monomérico quando separadas por filtração em gel. Contudo, a constante cinética de dissociação do dímero (koff) estimada em 277·10-6 s-1 sugere que para alcançar o estado monomérico é preciso passar por uma elevada barreira de energia de ativação (Ea) de cerca de 18,5 kcal. A explicação deste fenômeno tem respaldo na teoria de que proteínas possuem estados conformacionais, e no caso da Sfβgly, o estado dimérico e monomérico possuiriam diferentes conformações que também estariam associadas com a atividade da enzima. Mutações na interface do dímero planejadas para desestabilizar a ligação entre as subunidades validam que a atividade do monômero é menor comparada à fração contendo dímeros da enzima selvagem. Ainda com respeito a mutações, uma variante da Sfβgly com 47 mutações acumuladas na sua sequência gerou uma enzima monomérica e com capacidade de hidrolisar substrato com ligação αglicosídica, uma função rara entre as β-glicosidases. No capítulo II, a temática gira em torno de mutações em uma tirosina quinase que conferem resistência a medicamentos (inibidores) para tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (CML). O causador da CML e o alvo terapêutico é um domínio tirosina quinase da enzima Abl1-KD, que é constitutivamente ativa nesta doença. Para entender como as mutações de resistência atuam nas diferentes conformações da Abl1-KD, simulamos computacionalmente com o Rosetta o efeito estabilizador de mutações no resíduo e da estrutura no contexto da conformação. Além disso, através da inferência das sequências ancestrais de Abl1-KD, verificamos se as posições da estrutura primária mais conhecidas em conferir resistência aos inibidores sofrem algum grau de constrição evolutiva. Os resultados mostram que a energia conformacional da forma inativa estimada pelo Rosetta é 4,4 ± 2,2 REU (Rosetta Energy Units) mais estável comparada à conformação ativa, indicando que a conformação inativa é mais populada. Interessantemente, as mutações em posições que conhecidamente conferem resistência aos inibidores de tratamento da CML são capazes de remodelar a energia conformacional da Abl1-KD, tornando a conformação ativa mais estável, como no caso das mutações: M244V, G250E, Q252H, Y253H, F359VC e H396P. Em relação à energia individual dos resíduos, as mutações G250E, Q252H, Y253H, E255V, V299L, F359(C,V), e H396P estão mais estáveis na conformação ativa da Abl1-KD. Finalmente, a história evolutiva da Abl1-KD inferida por filogenia indica que as posições conhecidas por gerar resistência possuem uma menor taxa de variação de resíduo através de análise por matriz de peso scoreposição (PSSM). Em conclusão, mutações na Abl1-KD capazes de remodelar sua energia conformacional estabilizando sua forma ativa, ocorrem em posições moderadamente conservadas que são responsáveis por estabilizar a forma inativa da enzima, e estão envolvidas no fenótipo de resistência observado após abrupta pressão seletiva imposta pelos inibidores de quinases. (AU)

• Processo FAPESP: 18/18537-4 - Relação da estrutura quaternária e atividade enzimática da beta-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sfbgly)
• Beneficiário: Felipe Akihiro Melo Otsuka
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto