A ativação prolongada da subunidade p65 do fator nuclear NF-kappa-B sustenta o efeito persistente dos produtos de glicação avançada sobre a sensibilização inflamatória em macrófagos

Autor(es)

Sayonara Ivana Santos de Assis

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina (FM/SBD)
• Data de defesa: 2024-03-18

Membros da banca

Marisa Passarelli; William Tadeu Lara Festuccia; Helena Coutinho Franco de Oliveira

• Orientador: Marisa Passarelli

Resumo

Produtos de glicação avançada (AGE) induzem estresse inflamatório por intermédio da ativação do fator nuclear NF-kappa-B (NFKB), mediante ligação ao receptor para AGE (RAGE). A sinalização do RAGE converge com a do receptor 4 do tipo toll (TLR4) e os AGE sensibilizam macrófagos à estimulação inflamatória por lipopolissacarídeos (LPS). Este efeito é sustentado em macrófagos, persistindo mesmo após longo tempo em meio isento de AGE e são dependentes do controle glicêmico em indivíduos com diabetes mellitus (DM). Testou-se a hipótese de que a persistência da ação da albumina-AGE seja decorrente da ativação nuclear sustentada de NFKB. Sendo assim, determinou-se em macrófagos, tratados com albumina controle (C) e albumina-AGE, o tempo de persistência da sensibilização à estimulação inflamatória por LPS inferido pela 1) secreção de citocinas inflamatórias; 2) conteúdo nuclear das subunidades de NFKB, p50 e p65; 3) expressão de genes inflamatórios. A albumina-AGE foi preparada in vitro pela incubação com glicolaldeído 10mM, durante 4 dias a 37ºC, no escuro e a albumina-C, incubada apenas com solução tampão-fosfato. Macrófagos da linhagem RAW-264.7 sobrecarregados, por 24h com lipoproteínas de densidade baixa (LDL) acetilada, foram tratados com albumina-C ou AGE (2 mg/mL, 48 h), na presença ou ausência de HDL. A seguir, foram mantidos em meio isento dessas albuminas por diferentes intervalos de tempo e, posteriormente, incubadas por 24 h com LPS. Foram determinadas a expressão gênica de RelA, Nfkb1, Ager, Tlr4, IL6, TNF, Abca1 e Abcg1 por RT-qPCR, o conteúdo nuclear de p50 e p65 por Western blot e a secreção de citocinas inflamatórias TNF, IL-6 e IL-1beta, por ELISA. As comparações foram feitas por ANOVA de um fator ou teste t de Student (n=6). A albumina-AGE sensibilizou os macrófagos à estimulação por LPS, favorecendo maior secreção de TNF, IL-6 e IL-1 beta em, respectivamente, 1,5%, 9,4%, 5,6% em comparação à albumina-C (tempo zero). O aumento na secreção de TNF, IL-6 e IL-1beta permaneceu, respectivamente, até 24 h, 24 h e 12 h, mesmo após a remoção da albumina-AGE do meio, com uma área sob a curva maior em 1,6, 16 e 5,2 vezes, respectivamente; a incubação na presença de HDL não alterou o perfil inflamatório persistente. A expressão dos genes Il6 e RelA, (após 8 h da remoção das albuminas do meio de cultura) Il6 e Abca1 (após 24 h da remoção das albuminas do meio de cultura) foi maior nas células tratadas com albumina-AGE, em comparação à albumina-C. O conteúdo nuclear de p50 foi semelhante entre os grupos, mas o p65 permaneceu aumentado 2,9 vezes, por até 24 h, nas células tratadas com albumina-AGE em comparação à albumina-C. Os resultados evidenciam que a ativação prolongada da subunidade p65 do fator nuclear NF-kappa-B sustenta o efeito persistente dos AGE sobre alteração na expressão gênica e a secreção de citocinas inflamatórias em macrófagos desafiados com LPS, o que contribui para a memória metabólica celular (AU)

• Processo FAPESP: 21/04989-3 - Mediadores moleculares envolvidos na persistência do efeito dos produtos de glicação avançada sobre a resposta inflamatória e prejuízo no efluxo de colesterol em macrófagos
• Beneficiário: Sayonara Ivana Santos de Assis
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado