'Beta'-1,3 glucanases, proteases e quitinases: produção, purificação e aplicação

Autor(es)

Luciana Francisco Fleuri

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia de Alimentos
• Data de defesa: 2006-03-07

Membros da banca

Helia Harumi Sato; Gabriela Alves Macedo; Marcia Nitschke; Ranulfo Monte Alegre; Severino Matias de Alencar; Telma Teixeira Franco

• Orientador: Helia Harumi Sato

Resumo

O presente trabalho visou o estudo da produção, purificação e aplicação de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases. A linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 foi utilizada para o estudo da produção de b-1,3 glucanases e quitinases e as linhagens B26 e C. cellulans 191 foram utilizadas para a produção de proteases, em meios de cultivo contendo diferentes indutores. Foram realizados planejamentos fatorias 23, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura (oC) e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de b-1,3 glucanase foi verificado maior produção da enzima (0,64 U/mL) em meio de cultivo A composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 10 g/L de parede celular de levedura em tampão fosfato 0,2 M, pH 8,5, após 24 h de fermentação, a 33oC e 200 rpm. Nos planejamentos experimentais para a produção de protease pelas linhagens B26 e 191 foi verificado maior produção da enzima em meio de cultivo B composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 80 g/L de levedura seca utilizada como indutor em tampão fosfato 0,15 M, pH 6,5, após 30 h de fermentação a 20oC e 200 rpm, sendo obtido 5,01 U/mL e 4,25 U/mL, respectivamente. No planejamento experimental para a produção de quitinase foi verificado maior produção da enzima (7,06 U/mL) em meio de cultivo C composto por 4,0 g/L de extrato de levedura; 2,0 g/L de triptona; 4,0 g/L de MgSO4.7H2O; 1,2 g/L de KH2PO4; 2,8 g/L de K2HPO4 e 15 g/L de quitina neutralizada utilizada como indutor, com pH inicial de 5,5 após 72 h de fermentação a 25oC e 200 rpm. Todos os modelos obtidos foram preditivos e significativos a um nível de confiança de 95%. No estudo de produção das enzimas da linhagem C. cellulans 191 em fermentador de 5 L, a maior produção de b-1,3 glucanase, utilizando meio de cultivo A e 1,5 vvm e 3 vvm, foi respectivamente 0,32 U/mL e 0,72 U/mL, após 24 h de fermentação a 30oC. Na produção de protease em fermentador de 5 L, utilizando meio de cultivo B e 1,5 vvm foi obtido 1,87 U/mL e 2,34 U/mL, respectivamente, após 6 h e 30 h de fermentação a 30oC; enquanto que com 3 vvm, foi obtido 4,89 U/mL e 6,14 U/mL de protease após 6 h e 33 h de fermentação, a 30oC. Em fermentador de 5 L, a maior produção de quitinase em meio de cultivo C foi de 4,19 U/mL com 1,5 vvm após 168 h de fermentação e 4,38 U/mL de quitinase após 144 h de fermentação com 3 vvm, a 25oC. No estudo de produção de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases da linhagem C. cellulans 191 em frascos agitados, em meios de cultivo A, B e C, foram produzidos respectivamente, 1,12 U/mL de b-1,3 glucanase; 4,2 U/mL de protease e 6,9 U/mL de quitinase. A b-1,3 glucanase (45 KDa) foi purificada 11,83 vezes com rendimento de 25% em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50. Na purificação das proteases em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50 foram obtidas três frações de proteases denominadas P1, P2 e P3. A fração P3 apresentou duas bandas de massas moleculares de 14 e 16 KDa em eletroforese SDS-PAGE. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes com rendimento de 46,61% em resina de filtração em gel Sepharose CL4B200. A b-1,3 glucanase purificada apresentou atividade de lise de diversas leveduras e foi capaz de formar protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae KL-88. O pré-tratamento das leveduras com protease P3 purificada não aumentou a lise das leveduras com a ß-1,3 glucanase. A quitinase purificada foi capaz de lisar células de algumas espécies de fungos em suspensão aquosa, mas não foi capaz de inibir, o crescimento dos fungos em placas de ágar batata dextrose. A preparação bruta de quitinase apresentou halo de inibição do crescimento de alguns fungos estudados. Os produtos formados pela reação da b-1,3 glucanase purificada sobre a laminarina e da protease purificada sobre a levedura seca apresentaram capacidade antioxidante (AU)

• Processo FAPESP: 02/06003-7 - Produção de beta-1,3 glucanases, proteases líticas e quitanases de purificação e aplicação na lise de leveduras
• Beneficiário: Luciana Francisco Fleuri
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado