Retina de aves como sistema circadiano e sua modulação por luz e glutamato

Autor(es)

Leonardo Henrique Ribeiro Graciani de Lima

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Biociências (IBIOC/SB)
• Data de defesa: 2009-10-13

Membros da banca

Ana Maria de Lauro Castrucci; Debora Rejane Fior Chadi; Jose Cipolla Neto; Mauro César Isoldi; Regina Pekelmann Markus

• Orientador: Ana Maria de Lauro Castrucci

Resumo

O sistema circadiano das aves é composto pela retina, a região homóloga aos núcleos supraquiasmáticos de mamíferos (NSQ) e a glândula pineal. A retina apresenta muitos eventos fisiológicos rítmicos, como por exemplo os movimentos das células fotorreceptoras em vertebrados não mamíferos, a expressão de opsinas, regeneração do cromóforo visual e produção e liberação de melatonina e dopamina. Todos estes eventos rítmicos são coordenados para prever alterações nas condições luminosas que ocorrem durante o dia, otimizando a função retiniana. Neste trabalho foi investigada a expressão de componentes chave de um sistema circadiano, incluindo os dois genes de melanopsina, Opn4x e Opn4m, os genes de relógio Clock e Per2, e os genes das enzimas chave da síntese de melatonina, N-Acetiltransferase, e de dopamina, Tirosina Hidroxilase, em células da retina de embriões de galinha. Culturas primárias de retina de embriões de galinha com 8 dias foram preparadas no ZT0 (quando as luz é acesa) e semeadas na densidade de 107 células por frasco de 25 cm2 . As células foram mantidas em ambiente úmido, com 5% CO2, a 40o C, em escuro constante, fotoperíodo 12C:12E, fotoperíodo 12C:12E seguido de escuro constante, ou em escuro constante na presença e na ausência de glutamato 100 μM por 12 h. A extração de RNA total foi feita ao longo de 24 horas com intervalo de três horas tendo início no ZT0 do sexto dia. As amostras foram submetidas a RT-PCR seguido de PCR quantitativo para a quantificação de RNAm. Para confirmar a expressão da proteína OPN4x foi realizado ensaio imunohistoquímico com anticorpos anti-melanopsina de galinha desenvolvidos em coelho. Também foi feita a quantificação da concentração das proteínas OPN4x, CLOCK e TIROSINA HIDROXILASE através da técnica de Western Blot. A quantificação do RNAm em escuro constante não apresentou ritmos de transcrição para nenhum gene. Já as células mantidas em fotoperíodo 12C:12E apresentaram padrões rítmicos de transcrição para Clock, Per2, Opn4m, N-Acetiltransferase e Tirosina Hidroxilase. Glutamato 100 μM foi eficaz em induzir ritmo em Clock, e inibiu drasticamente a expressão de Tirosina Hidroxilase e, apenas mais pontualmente, de Opn4x e Opn4m. Ensaios de viabilidade celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo demonstraram que essa inibição não foi resultante de ação tóxica ou apoptótica do glutamato. O neurotransmissor não teve qualquer efeito sobre a transcrição de Per2 e de N-Acetiltransferase. A quantificação protéica não indicou a presença de ritmo para CLOCK, OPN4x ou TIROSINA HIDROXILASE. A grande variabilidade inter-ensaios nos resultados de quantificação protéica sugere uma menor sensibilidade e precisão para esse método, quando comparado a PCR quantitativo. Nossos resultados indicam que as células de retina de embrião de 8 dias de galinha em cultura já contêm um relógio funcional, porém, este necessita do ciclo claro-escuro ou glutamato para sua sincronização. (AU)

• Processo FAPESP: 04/12863-4 - Retina de aves como um sistema circadiano: função da proteína Clock, melanopsina, melatonina e dopamina em células da retina de pinto e sua modulação por glutamato
• Beneficiário: Leonardo Henrique Ribeiro Graciani de Lima
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto