Texto completo
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| Autor(es): |
Jaqueline Pesciutti Evangelista
Número total de Autores: 1
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| Tipo de documento: | Dissertação de Mestrado |
| Imprenta: | São Carlos. |
| Instituição: | Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT) |
| Data de defesa: | 2009-07-15 |
| Membros da banca: |
Otavio Henrique Thiemann;
Júlio César Borges;
Marcia Aparecida Silva Graminha
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| Orientador: | Otavio Henrique Thiemann |
| Resumo | |
O estudo do processo de tradução no metabolismo celular atrai o interesse de vários grupos, em particular, o estudo do 21o aminoácido, a selenocisteína. A incorporação da selecisteína foi descrita em Escherichia coli e recentemente em eucariotos. O primeiro passo desta via é iniciado pela Seril-tRNA Sintetase que aminoacila o Ser-tRNASec (SelC) com uma serina. Em E. coli, o segundo passo é realizado pela Sec-sintetase (SelA) que remove o grupo hidroxil da cadeia lateral da serina, formando um intermediário aminoacrilil. Este serve como aceptor de seleno-fosfato gerando a selenocisteína. Em eucariotos, o processo análogo é realizado pela PSTK e pela SepSecS, que fosforila e seleniza a serina respectivamente. Interessados nesta parte da via, iniciamos estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA Kinase de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA Sintetase de Trypanosoma brucei. Para o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de T. brucei não foi possível obter um clone sem mutação. Já o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de L. major foi clonado em vetor pET28 e a enzima foi expressa em células de E. coli porém com baixo rendimento impedindo a continuidade dos experimentos planejados. Portanto passou-se a investigar a enzima envolvida no primeiro passo da via, no caso, a Seril-tRNA Sintetase de T. brucei. Esta já se encontrava clonada e expressando em E. coli na fração solúvel. A proteína recombinante foi purificada com precipitação com 60% de sulfato de amônio e resinas de hidrofobicidade e de afinidade por níquel. Experimentos de gel nativo, DLS e fluorescência de anisotropia revelaram que, após a purificação, a enzima permanece estável e livre de agregações, possuindo um raio hidrodinâmico de 4,32nm e massa molecular de 110kDa. Acima de 150nM de proteína, ela encontra-se inteiramente na forma dimérica. Estabelecidos estes parâmetros, informações sobre a ligação com o Ser-tRNASec poderão ser obtidos a partir da técnica de anisotropia de fluorescência visto que experimentos iniciais realizados com a SerRS adicionando-se o Ser-tRNASec mostraram-se promissores. (AU) | |
| Processo FAPESP: | 06/54306-0 - Estudos moleculares da seril-trna-sintetase de trypanosoma brucei |
| Beneficiário: | Jaqueline Pesciutti Evangelista |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Mestrado |