Estudo estrutural de inibidores de serinoproteases extraídos de Triatoma infestans

Resumo

Este projeto propõe a determinação das estruturas terciárias das infestinas recombinantes 1-4, 3-4 e 4 a fim de identificar regiões estratégicas nestas moléculas responsáveis pela interação com o fator XIIa. Para tal propomos a produção, purificação e estudo estrutural das mesmas utilizando métodos de cristalografia de proteínas. Através da análise da estrutura destes inibidores serão propostas regiões chaves da interação dos mesmos com o fator XIIa. Para confirmação da importância de tais regiões serão produzidas moléculas mutadas que serão avaliadas cineticamente. Para tal temos como objetivos: 1. Produzir, purificar e caracterizar as infestinas 1-4, 3-4 e 4, caso este último apresente atividade inibitória; 2. Produzir cristais para experimentos de difração; 3. Análise da estrutura dos cristais formados por difração de luz Sincrótron; 4. Clonagem, expressão e purificação de inibidores mutantes nas regiões de interação enzima-imbidor, 5. Caracterização cinética dos mutantes frente a enzimas proteolíticas. Paralelamente à produção de cristais, serão realizadas mutações na região do sítio reativo dos inibidores podendo ser utilizada técnicas como "phage-display", para a seleção de inibidores mais potentes e/ou seletivos. Estes inibidores serão avaliados cineticamente. (AU)