Estudo da replicação do vírus dengue-2 sob a ação de drogas inibidoras do metabolismo celular

Resumo

O vírus Dengue-2 é membro da família flaviviridae, possui um genoma RNA de polaridade positiva, fita simples, de cerca de 11 kb, que codifica uma única poliproteina, incluindo três proteínas estruturais e sete não-estruturais. Este projeto tem como objetivo estudar os efeitos dos inibidores do metabolismo celular sobre a replicação do vírus dengue-2 em relação ao citoesqueleto, aumento do pH endossomal e a interrupção do fluxo vesicular do retículo endoplasmático para o aparelho de Golgi. A metodologia utilizará o cultivo de células C6/36, HeLa e Vero, sendo que as monocamadas confluentes destas células serão infectadas com vírus dengue-2, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 pfu por célula, para se obter o estoque viral. Para se ter certeza de que está ocorrendo a replicação viral, será realizado uma imunofluorescência indireta na monocamada celular, e será realizada a extração do RNA total do sobrenadante através do Kit QIAamp RNA Viral (QIAGEN, USA). O ensaio de inibição metabólica será realizado em monocamadas de células Vero e HeLa crescidas em placas de 24 cavidades, sendo estas tratadas com as drogas Cloroquina, Cytochalasin B e Brefeldin A em concentrações pré-determinadas, deixando-se as drogas em contato com as células e coletando-se amostras em períodos determinados. A ação das drogas sobre a acidificação endossomal, citoesqueleto e do fluxo vesicular e o conseqüente efeito na replicação viral serão analisados através da titulação viral (infectividade) em células e por PCR em Tempo Real. (AU)