Analise da expressao quantitativa dos genes codificadores das proteinas do virus dengue-2 durante a reaplicacao viral em condicoes normais e sob a acao de drogas.

Resumo

Os vírus dengue causam a mais importante doença causada por um vírus transmitido por artrópodes no mundo, particularmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Os vírus dengue (dengue-1, -2, -3, e -4) são membros da família Flaviviridae, possuem um genoma RNA de polaridade positiva, fita simples, com aproximadamente 11 kb, cuja replicação resulta na codificação de uma única poliproteína, que é processada em três proteínas estruturais (capsídeo, premembrana/membrana e envelope) e sete não-estruturais (NS1-NS5). Este projeto tem como objetivo principal a quantificação da replicação gênica e, portanto, da replicação do vírus dengue-2, em diferentes culturas celulares. Além disso, tentaremos interferir na replicação viral usando duas estratégias diferentes: 1) observaremos as possíveis alterações na replicação e expressão gênica dos genes codificadores das proteínas virais, na vigência do uso de dsRNAs silenciadores para regiões selecionadas do genoma dos vírus dengue, e 2) os efeitos de inibidores metabólicos na produção de novos vírus. Culturas celulares serão infectadas com dengue-2 e os RNAs serão extraídos dos sobrenadante e das monocamadas celulares, coletados em intervalos de horas e dias pós-infecção, e analisados para determinar a cronologia da replicação viral através do número de transcritos de RNA utilizando a técnica quantitativa de PCR em tempo real. Assim, se obtivermos sucesso com o primeiro objetivo, será possível inferir qual, ou quais, proteínas virais estarão sendo expressas em menor ou maior quantidade durante a replicação viral, bem como, em qual fase esta expressão ocorre. Se os resultados permitirem, será possível determinar qual (ou quais) genes codificadores das proteínas virais seria(m) alvos potenciais para o desenvolvimento de medicamentos antivirais. Além disso, este projeto tem como objetivo estudar os efeitos dos inibidores do metabolismo celular, tais como as drogas cloroquina, cytochalasin B e brefeldin A, sobre a replicação do mesmo vírus (dengue-2) em relação à desestruturação do citoesqueleto, aumento do pH endossomal e a interrupção do fluxo vesicular do retículo endoplasmático para o aparelho de Golgi, na intenção encontrar uma droga que possa atuar impedindo a replicação viral. (AU)