Deteccao e atividade do sistema oxido nitrico sintase/oxido nitrico em oocitos bovinos.

Resumo

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico detectado em vários tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos, desempenhando também funções variadas como vasodilatação, neurotransmissão e indução de morte celular. O NO é gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos, inclusive no sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o possível papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. O objetivo do presente projeto é de investigar a presença do sistema NOS/NO e a importância de sua atividade para a maturação in vitro de oócitos bovinos. O estudo envolverá a execução dos seguintes experimentos: 1) localização da NOS3 (uma das isoformas da NOS) no tecido ovariano por imunofluorescência; 2) detecção da NOS3 em oócitos antes e após a maturação in vitro (MIV) por imunofluorescência; 3) determinação a presença do RNAm e da proteína da NOS3 em oócitos antes e após a maturação in vitro por RT-PCR e western blotting, respectivamente; 4) avaliação da atividade da enzima em oócitos imaturos e maturados in vitro com uma sonda fluorescente intracelular específica para NO (DAF-2DA); 5) avaliação do papel do NO na MIV, em que os oócitos serão maturados in vitro na presença de concentrações crescentes do inibidor de NOS, (L-NAME, 0-1mM) ou do doador de NO (SNP, 0-1mM) e serão avaliados após esse período quanto à taxa de maturação nuclear (metáfase II) e citoplasmática pelo desenvolvimento de blastocistos após a fecundação e cultivo in vitro; 6) efeito da pré-maturação com roscovitina seguida de MIV na presença de doador de NO sobre o desenvolvimento embrionário pós-FIV (taxa de blastocistos). (AU)