Desenvolvimento de um vetor para expressão de lipoproteínas de Leptospira interrogans em Escherichia coli

Resumo

Lipoproteínas bacterianas constituem um grupo de proteínas de membrana que possuem a cisteína amino-terminal covalentemente ligada a ácidos graxos. Em eubactérias, as lipoproteinas são sintetizadas com um peptídio sinal que é clivado por uma peptidase sinal (Lsp) antes da ligação covalente aos ácidos graxos, normalmente palmitato. O processamento da lipoproteína ocorre no espaço periplasmático, depois da translocação da proteína para a membrana citoplasmática, através da maquinaria de secreção conhecida como Sec. A expressão heteróloga de lipoproteinas em E.coli com seqüência nativa de clivagem para Lsp, freqüentemente resulta na expressão da proteína recombinante com lipidação incompleta ou ausente. Neste projeto, pretende-se desenvolver um vetor de expressão heteróloga em E.coli que possibilitará a obtenção da proteína recombinante lipidada e localizada na membrana externa. Para tanto, uma seqüência codificante do peptídeo sinal de lipoproteinas, baseado na seqüência descrita para a lipoproteina ligante a mureína de E.coli, será sintetizada e clonada no vetor pET-37b(+). Para testar a habilidade deste novo vetor em expressar lipoproteinas, as seqüências maduras (sem peptídio sinal nativo) de seis prováveis lipoproteinas de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni serão clonadas. As proteínas recombinantes serão purificadas por cromatografia de afinidade a metal, avaliadas quanto a lipidação através de inibição da atividade da peptidase sinal por globomicina. (AU)