P. falciparum: marcadores moleculares de resistência

Resumo

Nosso laboratório reportou que cloroquina afeta a homeostase de cálcio em P. chabaudi (Gazarini et al., 2007; Passos e Garcia, 1998). Em Gazarini et al., 2007 propusemos que o mecanismo para ação do antimalárico englobaria a participação da maquinaria responsável pela manutenção da homeostasia de cálcio nestes parasitas. Dados recentes (Alves et al., 2011) indicam que cloroquina possui efeito similar em desfazer o gradiente de cálcio de vacúolo ácido em P. falciparum. Neste mesmo compartimento celular localiza-se a hemozoina, polímero inerte formado pelo heme, produto da degradação da hemoglobina, tóxico ao parasita. Em colaboração com o grupo do Prof Koiti Araki, IQ USP, utilizamos vários compostos derivados de metaloporfirina e inibidores da Heme Oxigenase recombinante de Plasmodium falciparum e da formação da hemozoina (Alves et al., submetido). O presente projeto tem como um dos objetivos sequenciar o genoma de cepas de P. falciparum resistentes à cloroquina e compará-lo - com relação à maquinaria molecular de homeostasia de cálcio – com o genoma de parasita não resistente à cloroquina. Para este objetivo, estamos utilizando a tecnologia inovadora do sequenciador coordenado pelo Professor Wilson Araújo da Silva Junior, do Departamento de Genética da USP de Ribeirão Preto. Para análise da informação proveniente do sequenciamento contaremos com a colaboração do Dr. Phil Rosenthal da UCSF, EUA. O Dr. Luis Marcelo Aranha de Camargo, (USP - Montenegro, Rondônia) e o Prof. Mariano Zalis da UFRJ também participam do projeto com o conhecimento de cepas resistentes em território nacional (Aranha Camargo et al., 2009). Através desta ferramenta, torna-se possível a análise comparativa de sequências de DNA de diversas linhagens resistentes de parasitas. Tendo em vista a hipótese de que alguns antimaláricos poderiam agir quebrando a homeostase de cálcio, é plenamente plausível supor que existam linhagens resistentes capazes de manter a homeostase do segundo mensageiro sob a ação desses antimaláricos. É de grande interesse descobrir se existem outras mutações capazes de conferir resistência aos parasitas, ou mesmo capazes de amplificar a resistência conferida pela mutação no gene Pfcrt. Em colaboração com o Prof. David Fidock da Universidade de Columbia, USA, parasitas P. falciparum DD2 resistentes a cloroquina e com mutações no gene PfCRT o qual codifica para a proteína PfCRT (Chloroquine resistant Transporter) foram cedidos para a investigação da sinalização de cálcio intracelular nas cepas 3D7, DD2 (resistente) e DD2(mutante no PFCRT). Os parasitas estão em cultura em nosso laboratório e estão sendo avaliados com relação a capacidade de manutenção de homeostasia de cálcio. Além disso, a hipótese de que possa ocorrer regulação intrônica em parasitas resistentes também há de ser considerada. Fazendo uso das linhagens resistentes a cloroquina fornecidas pelos colaboradores será possível realizar um exame mais totalitário nos genomas de linhagens resistentes, e por consequência, uma análise comparativa mais completa. Analisando em primeira instância os principais genes envolvidos na homeostase de cálcio, e em seguida, outras possíveis mutações, seríamos capazes de identificar marcadores envolvidos no mecanismo de resistência dos parasitas. A idéia inicial será testar cepas comprovadamente resistentes à cloroquina para investigar se há mudanças na sinalização de cálcio. Além do sequenciamento investigaremos possíveis mudanças de transcrição de genes da maquinaria de cálcio a partir de ensaios de PCR por tempo real. Em Nagamune e Sibley, 2006 os autores identificaram vários genes em P. falciparum que em comparação com outros genomas, devem codificar a expressão de proteínas cuja ação/modulação é dependente de cálcio. Dentre os genes listados destacam-se: PfATPase4; ATPase transportadora de cálcio 1; PfATPase6; PfATPase2; trocador de cálcio; calmodulina; proteína ligadora de cálcio; PfCDPK3; PfCDPK4; PfCDPK1; PfCDPK2; proteína quinase dependente de cálcio; proteína quinase dependente de cálcio-calmodulina. Em adição, neste projeto investigaremos a capacidade de drogas derivadas de quinonas - sintetizadas pelo Dr. Victor Ferreira (UFF - RJ) - em desfazer a homeostase de cálcio em cepas de P. falciparum resistentes e não resistentes à cloroquina e inibir o ciclo de vida do parasita Uma quinoteca contendo cerca de noventa quinonas sintetizadas pelo Dr. Victor serão utilizadas no screening. Em Sharma et al, 2013,, reportamos estudos de antimaláricos derivados de novas quinonas sintéticas, sendo que outros estudos estão submetidos a publicação (Shuck et al., submetido). Em adição, temos interesse em estudos de mecanismo de ação de novos compostos sintetizados baseados em modificações na estrutura das quinonas que resultarem em drogas mais potentes quanto a inibição do ciclo intraeritrocítico e/ou quebra de homeostasia de cálcio no parasita. Neste sentido, um dos compostos sintetizados pelo grupo do Prof, Vitor não apresentou toxicidade até a concentração de 16 µM (Shuck et al., submetido) e tem ação na mitocôndria do parasita. Este é um resultado encorajador, mostrando que e possível atuar melhorando o desenho das drogas atuais. Outros antimaláricos estão sendo estudados em nosso laboratório, tais como derivados de triterpenos (da Silva et al., 2013) e do ácido betulinico e ursólico (Innocente et al., 2012). Derivados de produtos naturais explorando a riqueza de nossa flora como potenciais antimaláricos também estão sendo estudados em colaboração com a Profa. Vanderlan Bolzani da UNESP de Araraquara. (AU)