Identificacao e estudo de expressao de variantes de poliadenilacao e de micrornas atraves de sequenciamento em larga escala.

Resumo

A maioria dos RNAs mensageiros (mRNA) de eucariotos adquire uma cauda não jodificante de adeninas em suas extremidades 3' durante a maturação, através de um processo denominado poliadenilação. Este processo consiste na clivagem do mRNA em um sítio específico e a posterior adição dos resíduos de adenina. A posição da clivagem na molécula do mRNA é definida pelo reconhecimento de seqüências específicas, denominadas sinais de poliadenilação (poliA), contidas na região 3' não traduzida (3' UTR) dos mRNAs. Mais da metade dos genes de mamíferos apresentam múltiplos sinais de poliA, o que pode levar à formação de transcritos variantes com diferentes 3' UTR. Estes processamentos alternativos podem influenciar a localização, estabilidade e transporte dos transcritos, resultando em uma alteração na expressão da proteína codificada pelos mesmos. Isto se deve ao fato de muitos elementos em eis envolvidos na regulação póstranscricional estarem localizados nas 3' UTRs. Um destes elementos são os sítios alvo de microRNAs (miRNA). Os miRNAs constituem uma classe de RNAs não codificantes pequenos que podem regular a expressão de um transcrito alvo ou a quantidade de proteína produzida pelo mesmo. Atualmente, estima-se que existam mais de 1000 miRNAs no genoma humano e que provavelmente os mesmos regulam a expressão de 30% dos nossos genes codificadores. Deste modo, acredita-se que os miRNAs possam estar envolvidos na regulação de importantes processos celulares, tais como a proliferação e diferenciação celular, e a apoptose. O presente projeto pretende utilizar uma nova tecnologia de sequenciamento em larga escala para identificar e avaliar a expressão de formas de poliadenilação alternativa. Para tanto, um protocolo original de construção de bibliotecas de cDNAs enriquecidas para a porção 3' dos transcritos será desenvolvido. As bibliotecas geradas serão compatíveis com o sequenciamento no sequenciador de nova geração 454 da Roche. Além disso, em paralelo, a avaliação em larga escala da expressão de miRNAs será feita em outro sequenciador de nova geração, o SOLiD (Applied Biosystems), recentemente adquirido pelo nosso grupo. Ao final, a análise simultânea nas mesmas amostras permitirá o estudo de associação da expressão de um determinado miRNA e o transcrito alvo correspondente. O desenvolvimento de um protocolo específico para a obtenção da porção 3' UTR dos transcritos gerará um ganho significativo na capacidade de identificação e avaliação da expressão de diferentes formas de poliadenilação através desta nova tecnologia de sequenciamento. Cabe ressaltar que tal estudo de associação em larga escala utilizando-se seqüenciamento é inédito. (AU)