Estudos funcionais de hemicelulases microbianas com potencial aplicação biotecnológica em biorrefinarias de biomassas hemicelulósicas

Resumo

A cana-de-açúcar é atualmente a opção de biomassa energética de maior produtividade de bioetanol por área plantada. Tem-se buscado alternativas viáveis para aumentar expressivamente a produção de etanol sem aumento da área plantada, com o intuito de tornar a matriz energética brasileira sólida e renovável. Consensualmente, a mais promissora é produzir etanol a partir da biomassa gerada como resíduo na produção do álcool de primeira geração. Para tanto, é necessário hidrolisar essa biomassa e liberar açúcares fermentescíveis. Porém, dada a recalcitrância dos resíduos, é complexa a tarefa de propor um processo de hidrólise eficiente, de baixo custo e que não gere compostos tóxicos que diminuem o rendimento da etapa de fermentação posterior. Nesse sentido hidrolisar completamente a biomassa depende da ação concertada (sinérgica) de várias atividades catalíticas distintas, principalmente celulases e hemicelulases, com as quais se espera obter níveis sinérgicos de rendimento para sacarificação destes polímeros complexos. Além disso, a presença de enzimas mesofílicas e extremofílicas em um coquetel multienzimático garantiria atividade sobre substratos lignocelulósicos numa faixa ampla de temperatura e de pH. Isso implicaria em versatilidade para os processos de hidrólise, e, consequentemente, resultados mais significativos e menores custos para o processo, tendo em vista que praticamente todos os coquetéis comerciais disponíveis atuam principalmente em temperas ótimas variando entre 50 e 55ºC numa faixa de pH em torno de 6,0. Estas condições podem tornar o processo de hidrólise limitado às condições ótimas para as enzimas disponíveis, dificultando alterações em etapas do processo na tentativa de otimizar a produção de etanol em abordagens em estudos de hidrólise seguido de sacarificação ou com baixos ou dispendiosos rendimentos para SSF (sacarificação e fermentação simultâneas), pois o crescimento e fermentação alcoólica feito pelas leveduras disponíveis atualmente se dá em temperaturas brandas, a aproximadamente 30oC (longe da temperatura ótima dos coquetéis comerciais).A partir dessas premissas esse projeto propõe um estudo que proporciona correlacionar a estrutura e função de algumas hemicelulases-chave (4 enzimas hemicelulásicas mesofílicas e hipertermofílicas) para montagem de um complexo hemicelulolítico versátil, com diferentes atividades catalíticas e atuante em ampla faixa de pH e temperatura. Para tanto, as enzimas serão clonadas em diferentes sistemas de expressão e terão seus parâmetros bioquímico-cinéticos determinados. Esses dados servirão como base para a construção de quimeras protéicas a partir de endoxilanases mesofílicas e hipertermofílicas, com o auxílio de técnicas como overlap PCR e extensão end-to-end e serão ligados posteriormente a domínios de ligação a carboidratos (CBM6) provindos da bactéria anaeróbica etanolgênica (Clostridium thermocellum). As construções gênicas serão então expressas e caracterizadas, em seguida o complexo de enzimas quiméricas e módulo catalíticos (tipo selvagem) terão suas atividades comparadas por diferentes ensaios e em condições variadas de (pH, temperatura e tipos de substratos). Estas enzimas serão estudas bioquimicamente (Vmáx, KM, Kcat) e biofisicamente (dicroísmo circular, calorimetria por DSCl) em trabalhos de colaboração com outros laboratórios deste centro de pesquisa.Serão feitas combinação de misturas enzimáticas frente à degradação de compostos ligno-hemicelulósicos em diferentes condições de preparo. A análise de sinergismo destes componentes será avaliada por meio de planejamentos experimentais baseado em mistura com diferentes combinações enzimáticas. Estes resultados poderão direcionar a melhor combinação de novos coquetéis que poderão contribuir para o aumento do rendimento focado no processo de hidrólise de biomassas vegetais e substratos sintéticos. (AU)