Análise mutacional dos resíduos do sítio ativo de fumarato hidratase de Leishmania major

Resumo

Leishmanioses, classificadas como doenças negligenciadas (NTD), são causadas por espécies diferentes do parasita leishmania e afeta 12 milhões de pessoas no mundo. Fumarato hidratase (FH) catalisa a hidratação/desidratação reversível de fumarato em S-malato. Eucariotos expressam duas isoformas de FH: a isoforma mitocondrial (FH-1) é bem conhecida por participar do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e também está envolvida na fermentação succinica; a isoforma citosólica (FH-2) é sugerido estar envolvida na produção de fumarato que atua como substrato para dihydroorotate dehydrogenase, uma enzima que participa da biosíntese de novo de nucleotideos de pirimidina. O papel vital das FHs em vias metabólicas essenciais sugere seu potencial como agentes terapêuticos. Estudos de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) identificaram a presença do cluster Fe-S nas FHs de Leishmania major (LmFH), e a eficiência catalítica em condições aeróbicas e anaeróbicas sugerem que estas enzimas são altamente sensíveis ao oxigênio. A estrutura cristalográfica da FH citosólica de L. major (LmFH-2) foi resolvida por SAD usando ferro como espalhador anômalo. LmFH-2 é a primeira estrutura resolvida da classe I das FHs e revela um novo fold. A estrutura cristalográfica de LmFH-2 foi resolvida em complexo com o substrato S-malato permitindo identificar os resíduos do sítio ativo nas FHs da classe I. Neste projeto, nós propomos elucidar o mecanismo das LmFHs usando mutação sítio-dirigida dos resíduos do sítio ativo de LmFH-2, em conjunto com a caracterização estrutural e cinética dos mutantes em condições anaeróbicas. Os resultados obtidos neste projeto irão contribuir para o entendimento do mecanismo catalítico das FHs da classe I, assim como abrirá um novo caminho para a luta contra a leishmaniose. (AU)